中华人民共和国国家标准
GB 15193.31-2026
食品安全国家标准
国家市场监督管理总局 中华人民共和国国家卫生健康委员会 发布
食品安全国家标准
大鼠体内外周血红细胞Pig-a基因突变试验
1范围
A.Piga）基因突变试验的基本方法和技术要求. 本标准规定了大鼠体内外周血红细胞磷脂酰肌醇聚糖A类（phosphatidylinositolglycan-elass
本标准适用于评价受试物对体细胞的致突变作用.
2术语和定义
2.1Pig-a 基因
位于X染色体，参与调控细胞膜糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）锚定蛋白合成的基因.
2.2突变成熟红细胞
发生Pig-a基因突变的成熟红细胞，表现为GP1锚定蛋白缺失.
2.3突变网织红细胞
发生Pig-a基因突变的尚未成熟的红细胞，表现为GPI镭定蛋白缺失.
2.4模拟突变细胞
检测时制作的突变细胞样本，表现出与实际突变样本相同的荧光特征，用于辅助流式细胞仪参数设置和软件数据分析.
3试验目的和原理
本标准用于检测受试物引起的红系前体细胞Pig-a基因突变情况.红系前体细胞主要位于骨髓，其发生突变可表现为外周血成熟红细胞和网织红细胞突变水平增高.Piga基因位于X染色体，其编码的蛋白质是GPI锚定蛋白合成的必需蛋白之一.因维性哺乳动物仅一条X染色体，雌性仅一条有功能的X染色体，故Pig-a基因的任一突变即可能造成基因产物失活，导致细胞表面GPI错定蛋白缺 失，进而导致细胞特定表面蛋白缺失（如CD59），表现为无法与荧光染料标记的抗体相结合，因此可由流式细胞仪检测区分：
4仪器和试剂
4.1仪器
流式细胞分析仪、电子天平、离心机、恒温水溶锅、冰箱、恒温箱和实验室常用采血器械等.
4.2试剂
外周血抗凝剂（如肝素钠、乙二胺四乙酸等）、磷酸盐缓冲液（pH7.2~7.4，不含Ca²、Mg²和酚红）、胎牛血清、检测用免疫荧光抗体（PEanti-rat CD61、APCanti-rat CD59）和核酸染料（SYTO 13）.
5试验方法
5.1受试物
5.1.1根据受试物的特性和试验目的，选择受试物掺人何料、饮水或胃方式给予.若受试物影响动物适口性应灌胃给予.
5.1.2受试物灌胃给予，应将受试物溶解或悬浮于合适的溶媒中，首选溶媒为水，不溶于水的受试物可 使用植物油（如橄油、玉米油等），不溶于水或油的受试物亦可使用羧甲基纤维素、淀粉等配成混悬液或糊状物等，受试物应新鲜配制，有资料表明其溶液或混悬液储存稳定者除外.应每日在同一时段灌胃1次，每周称重2次，根据体重调整灌胃体积.一般滥胃体积不超过10mL/kg体重，如为水溶液时，最大灌胃体积可达20mL/kg体重；如为油性液体，灌胃体积应不超过4mL/kg体重：各组灌胃体积一致.
5.1.3受试物掺入何料或饮水给予，要将受试物与饲料（或饮水）充分混匀并保证该受试物配制的稳定性和均一性，以不影响动物摄食、营养平衡和饮水量为原则.受试物掺人饲料比例一般小于质量分数5%，若超过5%（最大不超过10%）时，应调整对照组饲料营养素水平（若受试物无热量或营养成分，且添加比例大于5%时，对照组饲料应添加甲基纤维素等，掺人量等同高剂量），使其与受试物组何料营养营养素水平，使其与对照组饲料营养素水平保持一致.受试物剂量单位是每千克体重所摄入受试物的 素水平保持一致，同时增设未处理对照组：亦可视受试物热量或营养成分的状况调整受试物剂量组饲料毫克（或克）数，即mg/kg体重（或g/kg体重），当受试物掺人何料其剂量单位亦可表示为mg/kg（或g/kg）饲料，掺人饮水则表示为mg/mL水.受试物掺人饲料时，需将受试物剂量（mg/kg体重）按动物每100g体重的摄食量折算为受试物饲料浓度（mg/kg饲料）.
5.2实验动物
5.2.1动物选择
实验动物的选择应符合GB14922有关规定.可选用4周龄~12周龄大鼠，推荐5周龄~6周龄大鼠.若受试物的毒性、代谢和生物利用度等方面在两性别动物之间没有明显差异，可选择单一性别（推荐雄性）进行试验：否则应使用两种性别动物进行试验.试验开始时，动物体重差异应不超过单一性别平均体重的土20%.每组单一性别动物数应不少于6只.
5.2.2动物准备
试验前，动物在动物房应至少进行3d~5d环境适应和检疫观察.适应期结束后进行外周血Pig-a环恢复后开始试验. 基因突变检测一次，排除突变背景异常的实验动物，经筛选的实验动物继续何养至少6d，待外周血循
5.2.3动物饲养
实验动物饲养条件、饮用水应符合GB14925，饲料应符合GB14924的有关规定，试验期间动物自由饮水和摄食.
5.3剂量
5.3.1分组
试验应至少设3个受试物剂量组，1个阴性（溶媒）对照组和1个阳性对照组.对照组动物与受试物组处理方法相同，仅给予物质不同.若试验结束后进行恢复期观察，至少需要留有阴性（溶媒）对照、阳性对照和高剂量组，推荐阳性对照物参见附录A.
5.3.2剂量设计
受试物剂量可根据实验方案，参考相应重复剂量毒性试验设计，最高剂量组原则上应使部分动物出现比较明显的毒性反应，但不引起死亡：低剂量不宜出现任何观察到的毒效应，相当于未观察到有害25%作为最高剂量：若连续90d给予受试物，以LD的5%~15%作为最高剂量.在此剂量下设儿个 作用剂量（NOAEL）.能求出半数致死量（LD）的受试物，若连续28d给子受试物，以LD的10%~剂量组，一般递减组间距以2倍～4倍为宜，对于求不出LD的受试物，高剂量组按以下顺序设计：
a）根据预实验结果，停止给予受试物后3d内，相对于阴性（溶媒）对照组网织红细胞比例显著降b）10 g/kg体重： 低，但降低幅度不超过阴性（溶媒）对照组的80%：c）人可能摄入量的100倍：d）一次最大淮胃剂量.
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6.1受试物给予
受试物推荐连续给予28d，也可与重复剂量毒性试验整合后连续给予更长时间（如90d）.
6.2动物观察
试验期间至少每天观察一次动物的一般临床表现，并记录动物出现中毒的体征、程度和持续时间及死亡情况.每周记录体重、摄食量，计算食物利用率：试验结束时，计算动物体重增长量、总摄食量、总食物利用率，受试物经饮水给予，应每日记录饮水量.如受试物经掺入饲料或饮水给予，应计算和报告受试物各剂量组实际摄人剂量.
6.3采样时间
动物适应期结束后进行采样检测一次，排除突变背景异常的实验动物.开始给予受试物当天计为第1天，试验按照以下时间点进行采样：
b）受试物给予时间为28d时，应至少在试验第28天~第31天进行一次采样检测； a）受试物给予时间少于28d时，应分别在试验第15天和第30天进行两次采样：c）受试物给予时间为90d或更长时间时，应至少在试验第28天～第31天进行一次采样检测，若需要在试验结束时再次采样检测，则应在停止给予受试物后3d内进行：
每个采样时间点均应同时采集阴性（溶媒）和阳性对照样本，阴性（溶媒）对照组突变類率应在本实验室历史数据范围内.
6.4标本采集和保存
在符合动物伦理的条件下，从适当的血管中采血，每次采集血量最小为20uL，不超过300pl，样
本取出后需立刻置于抗凝剂中混匀，于2℃～8℃保存，5d内完成检测.
6.5检测方法
6.5.1试剂配制
6.5.1.1表面抗原染液：每个样本（20 pL 外周血）对应3 μg APCanti-rat CD59、1pg PEanti-ratCD61，2%体积胎牛血清，加人磷酸盐缓冲液至100L，临用前配制，注意避光.6.5.1.2SYTO13染液：每个样本（20L外周血）对应染色体系为1mL，使用磷酸盐缓冲液配制，终浓 度为150nmol/L.临用前配制，注意避光.
6.5.2染色
取20gL抗凝血加人100gL表面抗原染液混匀，4C避光染色30min.表面抗原染色结束后，将细胞转移至15mL离心管中（内含10mL磷酸盐缓冲液）300g/min离心5min.清洗一次.弃上清 液，收集底层细胞（约20gL），重悬于含有1mLSYTO13染液的离心管中，混匀后37C避光孵育30min.孵育后将样本转移至流式细胞管中，4C避光保存待检.染色后的样本应于3h内完成检测.
6.5.3参数设置和质量控制
式进行制备，
a）采用阴性对照动物外周血，制作 SYTO13单染样本，并同时制备SYTO13、APCanti-ratCD59、PE anti-rat CD61三染样本.使用90pL单染样本与210 pL三染样本混匀，转移至流式细胞管中4℃避光保存待检.该模拟突变细胞预期突变率为300000×10b）使用经阳性物质（表A.1）诱导的大鼠外周血样本，进行常规染色后作为模拟突变细胞.使用 该种类模拟突变时，需提前制备并采取适当方式冻存样本，每次试验前取用，样本的红细胞突变率不低于100×10.6.5.3.2使用空白样本和单染样本完成仪器参数调整后，进行设门，具体设门方法见附录B.
6.5.3.3实验室应建立历史阴性对照数据集，用于评估试验方法的可接受性，以及排除背景异常的实验前动物突变背景筛选时的数据.历史阴性对照数据集的建立应注意以下儿点： 动物.用于构建历史阴性对照数据集的数据可来源于试验中使用的阴性（溶媒）对照组数据，以及试验
a）初次构建数据集应纳人不少于30只动物的数据同一动物连续采集血样只能纳人1次；b）年龄较大的实验动物（例如8月龄～12月龄）应单独设立数据集：c）若实验方案产生较大变化（例如改变染色方案），或其他可能对检测结果产生显著影响的因素改变（例如更换流式细胞仪），应建立新的历史阴性对照数据集.
6.5.4流式细胞仪检测
6.5.4.1检测目标细胞群为网织红细胞群（reticulocytes，RETs）和成熟红细胞群（red blood cells，RBCs）.APC/SYTO13为野生型网织红细胞群，APC/SYTO13一为野生型成熟红细胞群，6.5.4.2分析指标包括网织红细胞比例、网织红细胞突变率和成熟红细胞突变率.每个时间点每只动 APC-/SYTO13为突变型网织红细胞群，APC-/SYTO13-为突变型成熟红细胞群.物应至少分析1×10个成熟红细胞，0.3×10个网织红细胞.
网织红细胞比例（%）的计算见式（1).
RET** RET
