中华人民共和国国家标准
GB/T 35331-2017
Detection and identification of Didymella lycopersici Klebahn
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国中山出人境检验检疫局. 本标准主要起草人：崔铁军、罗加风、陈定虎、刘跃庭、黄国明、杨韶勇.
番茄亚隔孢壳茎腐病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了番茄亚隔孢壳茎腐病菌的检疫鉴定方法.
检疫鉴定. 本标准适用于番茄及其他番茄亚隔孢壳蒸腐病菌寄主种子、植株、果实中番茄亚隔孢壳茎腐病菌的
2番茄亚隔孢壳茎腐病菌的基本信息
学名:Did ymela lyeopersici Klebahn. 中文名：番茄亚隔孢壳茎腐病菌无性世代学名：Phoma lycopersici Cooke.异名 :Boeremia lycopersici (Cooke)Aveskamp Gruyter &. Verkley.Ascoch ytα lycopersici (Plowr.) Brunaud.英文名：ascochyta blight fruit rot of tomato leaf spot of tomato stem canker of tomato stem Diplodina Lycopersici Hollos.rot of tomato
分类地位：番茄亚隔孢壳茎腐病菌属真菌界（Fungi），子囊菌门（Asycota），盘菌亚门（Pezizo-mycotina），座囊菌纲（Dothideomycetes），格孢菌亚纲（Pleosporomycetidae），格孢菌目Pleosporales，小双胞腔菌属（Didymella）.无性世代Phoma ycopersici Cooke，属腔孢纲（Coelomycetes），球壳孢目 （Sphaeropsidales），蒸点霉属（Phoma）.
传播途径：病菌依靠带菌种子及病残体远距离传播.
番茄亚隔孢壳茎腐病菌的其他信息参见附录A.
3方法原理
病原菌为害症状、培养性状、形态特征、致病性测定及代谢产物Antibiotic“E”的测定结果作为番茄亚隔孢壳茎腐病菌检疫鉴定的依据.
4仪器用具和主要试剂
4.1仪器用具
4.1.1仪器
体视显微镜、生物显微镜、超净工作台、生物培养箱、电子天平、高压灭菌锅、常规冰箱（一20C）
4.1.2用具
培养ⅢL（直径90mm）、白瓷盘、三角瓶、摄子、手术剪、手术刀、接种针、一次性注射器（1mL）、棉纱、脱脂棉、酒精灯、离心管（2mL）
4.2主要试剂
葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素、燕麦片、麦芽膏、无水乙醇、1.0%次氯酸钠（NaClO）、0.1%氢氧化钠(NaOH).
见附录B. 马铃薯葡萄糖选择性培养基PDA、麦芽提取物培养基MEA、燕麦培养基（OA，培养基制备方法参
5病菌的鉴定
5.1疑似材料挑选
5.1.1种子中疑似材料挑选
将待检样品倒入洁净白瓷盘内，挑选干癌、弱小、畸形的可疑病种子和植株残体作为实验材料，植株残体包括枝、叶、叶柄等.
5.1.2植株疑似材料挑选
取待检植株，仔细观察植株枝、叶、果实上病菌为害症状（参见A.4、图A.1），枝条基部是否有黑福有病菌的子实体（分生孢子器），发现病菌子实体的，直接用灭菌的挑针或牙签挑取，制片镜检显微镜下 色病斑，枝条上部是否有溃疡病斑，叶片上是否有同心轮纹状病斑，果实是否有腐烂，枝、叶、果实上是否观察分生孢子器、分生孢子的形态特征.可疑的枝、叶、果实材料立即进行病菌分离培养.
5.2分离培养
5.2.1实验材料前处理
0.5%的次氯酸钠溶液消毒5min，无菌水冲洗3次，灭菌滤纸吸干水分后培养：疑似材料为果实，果实病 疑似材料为植株的枝、叶，用自来水充分冲洗，取病健交界组织，剪成约0.4cm×0.4cm小块，用健交界处组织用75%乙醇擦拭表面消毒，再用灭菌针挑取小块组织进行培养.
种子中挑选出的植株残体和可疑种子分别用纱布包好，放入0.5%的次氯酸钠溶液中，消毒5min，灭菌水冲洗3次，种子于无菌条件下22℃保湿24h，再置于-20℃下冰冻24h后培养，经表面消毒后的植株残体，用灭菌滤纸吸干水分后直接培养.
5.2.2病菌分离培养
前处理后的实验材料置马铃薯葡萄糖选择性培养基PDA平板上，每Ⅲ放置4粒~5粒或4块～5块，18C～20C，12h光照黑暗交替培养.培养3d后开始观察，发现乳白色或白色可疑菌落，立即用PDA、MEA、OA培养基分离纯化.7d后记录菌落培养性状，包括菌落生长速度、颜色，形状等，体视 显微镜下观测分生孢子器产生情况，生物学显微镜下测定分生孢子器、分生孢子形态特征及大小，对菌落性状及病菌形态特征拍照留存.
5.3致病性测定
灭菌土中种植番茄，幼苗高15cm，约6片～8片叶时接种.待测菌株PDA上培养10d后，取菌落中分生孢子黏液制成孢子悬浮液（孢子适宜浓度为1×10CFU/mL），选用健壮番茄幼苗，茎杆用75%乙醇表面消毒，无菌水冲洗3次，吸干水分，分生孢子悬浮液针刺接种，用湿润脱脂棉覆盖接种部位，以无菌水接种为对照，接种后放入18C～20C培养箱内保湿黑暗培养，2d后移去脱脂棉，12h光照黑暗交替继续保湿培养.
接种5d后观察发病情况，如出现可疑病斑，取病健交界处组织用75%乙醇表面消毒后，置马铃薯葡萄糖选择性培养基PDA上培养并进行病菌再分离.
5.4Antibiotic“E”NaOH颜色反应
Antibiotic“E"发生氧化反应，随着酸碱度的改变其颜色也发生一系列的变化，由紫红色变为深蓝绿色 番茄亚隔孢壳茎腐病菌的近似种培养过程中产生代谢产物Antibiotic“E”，在碱性条件下再转变为红色，培养基变为黄色.
在麦芽提取物培养基MEA上培养7d后新鲜菌落的边缘附近滴人1滴0.1%NaOH溶液，观测液滴边缘、中心部位及培养基颜色变化情况.
6鉴定特征
6.1培养性状
番茄亚隔孢壳茎腐病菌菌落生长较快，生长速度（直径）：PDA上4mm/d~7mm/d、OA上7mm/d~9mm/d、MEA上5.5mm/d~8mm/d，菌落平铺不隆起，边缘规则，PDA上气生菌丝发达紧密，毡状，菌落初为乳白色，老熟后菌落中部通常为灰色或暗橄榄绿色，培养基底部为深橄榄绿色至黑 色，菌落边缘为白色的环带；MEA和OA上菌落较PDA上稀疏，菌丝短絮状或毡状，MEA上菌落通常为暗绿色，OA上菌落为白色、灰白色或灰褐色，有不明显的环痕（参见图C.1）.番茄亚隔孢壳茎腐病菌菌落中常产生致密的气生菌丝，培养7d~10d后，培养基质中产生大量分生孢子器，菌落中或菌落表层也有分生孢子器产生但数量少于培养基质中分生孢子器初期为黄色很快变为暗黄色或黑色孔 口处溢出淡粉色或肉色的分生孢子黏液（参见图C.2）.
6.2形态特征
分生孢子器壁为拟薄壁组织，极薄易破裂，培养基上大小为120μm~210μm，寄主上为180pm~ 无性态形态特征：分生孢子器黑褐色至黑色，多埋生于培养基质内，球形至不规则形，散生，单孔口，250μm，分生孢子器常释放出淡粉色或肉色的分生孢子黏液.分生孢子器内同时存在单胞和双胞两种分生孢子，单胞的分生孢子较多，无色透明，卵圆形、椭圆形或肾形，具0个～2个明显或不明显油球，大小为（2.0μm~4.0μm）×（4.0μm~8.0μm），双胞分生孢子较少，无色，透明，长椭圆形、肾形，分隔处稍有缩，具0个~4个明显或不明显油球，大小为（3.0pm~4.5μm）×（7.0pμm~10.0μm）（参见 图 C.2).
有性态形态特征：子囊壳具近球形，浅棕色，具突起的喙，培养条件下子囊壳直径120um~200μm，寄主上直径130μm～250μm：子囊椭圆柱形或棍棒形，无柄或具短柄，子囊壁双层，培养基上大小为（50μm~70ym）×（8μm~9μm），寄主上大小为（70μm~95μm）×（6μm~10ym）;子囊含子 囊孢子8个，子囊孢子无色，梭形、椭圆形，两端稍钝，双胞，隔膜处稍缓缩，各具1油球，大小为（12μm~18μm）×（5pm~6μm）（参见图C.2）.有性阶段子囊壳很少产生，需经过越冬阶段在落人土壤中的病残体上产生，培养基上也难产生，且培养时间长.
番茄亚隔孢壳茎腐病菌与番茄上近似种的区别参见附录D.
6.3致病性测定的症状表现
接种7d后，接种部位出现黑褐色梭形病斑，病斑进一步扩展环绕茎杆，茎出现枯萎坏死（参见图 C.3)
发病植株茎部病健交界处组织消毒后分离培养，一周后长出6.1及6.2所述典型菌落和分生孢子器，可证明分离菌是番茄亚隔孢壳茎腐病菌.
