ICS 67.180.20 分类号：X69备案号：53763-2016
QB
中华人民共和国轻工行业标准
QB/T4915-2016
工业用角质酶制剂
Cutinase preparationsforindustry
中华人民共和国工业和信息化部发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由中国轻工业联合会提出.
本标准由全国食品工业标准化技术委员会工业发酵分技术委员会（SAC/TC64/SC5）归口，
本标准起草单位：江南大学、山东隆大生物工程有限公司、湖南鸿鹰祥生物工程有限公司、武汉新华扬生物股份有限公司、青岛蔚蓝生物集团有限公司、中国生物发醇产业协会.
本标准主要起草人：李晓燕、陈晟、郭庆文、詹连生、陈亮珍、王永兰、王晋.
本标准为首次发布.
工业用角质酶制剂
1范围
装、运输、贮存. 本标准规定了工业用角质酶制剂的术语和定义、产品分类、要求、试验方法、检验规则和标志、包
本标准适用于经微生物发酵、提纯制得的角质酶制剂的生产、检验和销售.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文
GB/T191包装储运图示标志（GB/T191-2008，ISO780:1997，MOD）GB5009.3-2010食品安全国家标准食品中水分的测定GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，ISO3696:1987，MOD）QB/T1803-1993工业酶制剂通用试验方法 GB/T23527蛋白酶制剂
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3. 1角质酶cutinase角质水解酶
能催化水解角质得到脂肪酸单体的酶.
3.2 角质酶活力activityofcutinase
在30C、pH8.0，每分钟催化对硝基苯丁酸酯水解生成1μmol对确基苯酚消耗酶量.
4产品分类
按产品形态分为液体和固体两种剂型.
5要求
5.1感官要求
5.2理化要求应符合表1规定.
表1理化要求
项目 液体剂型 固体剂型鉴别 通过试验 通过试验酶活力*[U/mL（或U/g）] > 750 750pH (25℃) 6.0~9.0 -
液体剂型 固体剂型干燥失重/%细度（0.4mm标准筛通过率）%具体规格可按供需双方合同的要求执行.如有特殊要求，按双方合同确定.
6试验方法
本标准中的试剂和水，在未注明其他要求时，均指分析纯（AR）和GB/T6682规定的水（三级水）.本标准中所用的溶液，在未注明任何溶剂配制时，均指水溶液.
取适量样品置于清洁、干燥的白瓷盘中，在自然光线下 进行观察.
6.1感官
6.2鉴别
6.2.1原理
6.2.2试剂和溶液
实验室常用和下列试剂和溶液适用于本标准.
6.2.2.1草酸缓冲液
称取草酸4.0g，草酸铵16.0g，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解，定容至1000mL.
6.2.2.2氯仿-甲醇溶液
量取氯仿800mL，甲醇400ml，混合均匀.
6.2.2.3酶处理液
6.2.2.4醋酸缓冲液（pH4.0） 称取146.0g无水醋酸钠和480.0g冰醋酸，用蒸馏水定容至1000mL
6.2.2.525mol/L磷酸钾缓冲液（pH8.0）溶解，定容至1000mL.
6.2. 2.6 0.02mol/L氢氧化钠容液
称取氢氧化钠0.8g，精确至0.001g，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解，定容至1000mL.6. 2. 2.7 酶液
称取固体样品0.1g，精确至0.001g，溶解于约0.3mL去离子水中，搅拌溶解.液体酶茂直接使用.6.2.2.8苹果角质底物
草果皮在草酸缓冲液中煮至果肉完全去除，捞出果皮，清洗，真空干燥，剪碎：苹果皮放入在1L氯仿-甲醇溶液中搅拌萃取过夜，过滤、清洗、真空干燥：苹果皮在1L酶处理液中搅摔过夜，过滤、清洗、真空干燥：重复上述氯仿-甲醇溶液萃取和酶处理液处理步骤.苹果皮在醋酸缓冲液中处理搅拌处理16h，过滤、清洗、真空干燥.
6.2.3仪器
实验室常用和下列仪器适用于本标准.
6.2.3.1自动移液枪（50μL、200uL、1mL、5mL）.
6.2.3.2碱式滴定管（10mL）.
6.2.3.3恒温水浴锅.6.2.3.4离心管（1.5mL、5mL）.6.2.3.5真空干燥箱.6.2.3.6抽滤瓶（1L），
6.2.4鉴定试验
反应体系10mL，包括10g/L草果角质、25mmol/L磷酸钾缓冲液（pH8.0）、0.25mL酶液，空白用上述磷酸钾缓冲液代替酶液，50℃，150r/min保温4h，用0.02mol/L的氢氧化钠溶液滴定生成的脂防酸，其中氢氧化钠净用量大于2mL为通过鉴别.
6.3活力
6.3.1原理
角质酶水解角质后生成的脂肪酸可通过碱滴定进行定量：角质酶水解对硝基苯丁酸酯（pNPB）产生的对硝基苯酚在405mm处显色，可通过分光光度法定量.
6.3.2试剂和溶液
实验室常用和下列试剂和溶液适用于本标准.
6.3.2.1三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（10mmol/L、pH8.0的Tris-HCl缓冲液）：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）1.210g、氯化钠0.584g，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解，用盐酸（HC1）调节pH至8.0，定容至1000mL.
6.3.2.250mmol/L对硝基苯丁酸酯溶液：称取对硝基苯丁酸酯（pNPB）0.1046g，用乙定容至10mL， -18℃保存.
6.3.3仪器
实验室常用和下列仪器适用于本标准.
6.3.3.5离心管（1.5mL、5mL）.
6.3.4样品的制备
取样品溶解、搅拌，取上清液进行适当稀释，稀释倍数以控制吸光值A在0.2~0.5为宜.
6.3.4.2液体酶液的制备
取样品进行适当稀释，稀释倍数以控制吸光值4在0.2~0.5为宜.
6.3.5测定
6.3.5.1对硝基苯酚标准曲线的制作：
称取0.0139g对硝基苯酚，用Tris-HC1缓冲液定容至1000mL，配制成100μmol/L的对硝基苯酚母液，再用10 mmol/L、pH8.0的 Tris-HC1缓冲液稀释至0μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80μmol/L、100μmol/L.缓冲液在30C水浴中保温，以去离子水调零，用1cm玻璃比色Ⅲ在分光光度 计上测定波长为405nm时的吸光值，以对硝基苯酚浓度c为横坐标，吸光值4为纵坐标，绘制标准曲线A=a×cb（标准曲线的相关性系数需达到0.999以上）.
6.3.5.2角质酶活力测定：
缓冲液在30C水浴中保温，用移液枪准确移取Tris-HCI缓冲液1.5mL至1cm玻璃比色m中，在吸收波长405nm处调零.用移液枪准确移取Tris-HCl缓冲液1.44mL至1cm比色Ⅲ中，用移液枪移取30uL待
