中华人民共和国水产行业标准
对虾玻璃苗弧菌病诊断方法
Diagnostic method for shrimp translucent post-larva vibriosis
中华人民共和国农业农村部 发布
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出.
对虾玻璃苗弧菌病诊断方法
1范围
本文件描述了对虾玻聘苗弧菌病（translucent post-larva vibriosis，TPV)诊断的试剂和材料、仪器设备、临床症状、样品，以及组织病理学检测、荧光定量PCR检测和综合判定的方法.
本文件适用于致玻璃苗弧菌（Vibrio spp.causingTPV）引起的对虾玻璃苗弧菌病的流行病学调查、诊断、检疫和监测.
2规范性引用文件
仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本 下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件，文件.
GB4789.7食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验GB/T28630.4-2012白班综合征（WSD）诊断规程第4部分：组织病理学诊断法 GB/T28630.2-2012白斑综合征（WSD）诊断规程第2部分：套式PCR检测法SC/T7011水生动物疾病术语与命名规则SC/T7103-2008水生动物产地检疫采样技术规范
3术语与定义
SC/T7011界定的术语和定义适用于本文件.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.B-细胞：分泌细胞（blister cell) BC：细菌定殖（bacterial colonization)BHQ1：黑洞荧光淬灭剂(black hole quencher-1)bp:碱基对(base pair)Cr值：阔值循环数，即实时荧光定量PCR检测中荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数（cycle-threshold value) DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid)dNTPs：脱氧核糖核书三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate）F-细胞：纤维细胞（fibrillar cell)HE：苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining） FAM：双基荧光素（6-Carboxyfluorescein）PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)PFA：多聚甲醛固定液（paraformaldehyde fixative)qPCR:实时荧光定量 PCR(real-time quantitative polymerase chain reaetion)R-细胞：储存细胞(reserve cell) RNA：核糖核酸（ribonucleic acid)Spv：沙门氏菌质粒毒力基因（Saimonella plaxmid iralence gene）TAMRA：四甲基罗丹明叠氮化物（tetramethylrhodamine)Taq ：水生栖热菌（Thermas αqneticus）
TedB：艰难梭菌杀虫毒素B基因（Cloxtridium diffcile insecticide B gene)TPD:对虾“玻璃苗”(shrimp translucent post-larva disease)VHVP;弧菌高毒力蛋白（vibrio highvirulent protein） TPV：对虾玻璃苗弧菌病（shrimp translucent post-larva vibriosis)Vrpv:致对虾玻璃苗弧菌（Vibrio spp.causing TPV)uhup：弧菌高毒力蛋白基因（vibrio highuiralernt protein gene）
VIC：多管水母维多利亚绿色荧光蛋白（Aequorea wictoria green fluorescent protein)hup-2：弧菌高毒力蛋白基因-2（vibrio highvirxlenprotein gene-2）5试剂和材料除非另有说明，在分析中仅使用燕馏水、去离子水或相当纯度的水.5.1中性树胶.5.2二甲苯：分析纯，5. 4dNTPs（各 2.5 mmol/L):dATP、dUTP、dGTP、dCTP各 2.5 mmol/L 的混合物，-20℃保存. 5.395%乙醇：分析纯.5.5MgCl（25 mmol/L)，20℃保存.5.610×PCR缓冲液，无Mg离子，-20C保存.5.7Taq 酶（5 U/uL)，20C保存.5.8PFA固定液；按A.1配制.5.9苏木精染色液：按A.2配制.5.101%伊红储存液：按A.3配制.5.111%焰红储存液：按A.4配制. 5.12伊红-焰红染色液：按A.5配制.5.13粘片剂：按A.6配制.5.1485%乙醇：按A.7配制.5.1580%乙醇：按A.8配制.5.1675%乙醇：按A.9配制.5.1770%乙醇：按A.10配制.5.1850%乙醇：按A.11配制.5.19组织病理学检测阳性对照：受Vv感染且显示明显病理变化的对虾仔虾肝胰腺组织切片.5.20组织病理学检测阴性对照：未受V感染的健康对虾仔虾肝胰腺组织切片. 5.21第一套引物和探针：引物与探针一20℃保存：引物和探针序列为：vhvp_SpvB-F1 5′-AGTCGTTTGGAGTATTGGGTG-3';vhvp_SpvB-R1:5'-GCCATCAGAGGTGTAGATCAC-3';vhvp_SpvB-P1 :5′-6-FAM-TCTTCGAGTGCTGCGACCACTTT-TAMRA-3'.5.22第一套引物和探针：引物与探针-20℃保存；引物和探针序列为： vhvp_TedB-F2;5′-GTAATCGTTTGGTTAGCACCG-3';vhvp_TedB-R2:5'-ACCAAACCCACGGAACTC-3′;vhvp_TedB-P2:5'-VIC-CACGGCCATCCCAGACTCCAT-BHQ1-3'.5.23荧光定量PCR检测阳性对照：已知受V感染的对虾肝胰腺组织DNA，或Vv菌液DNA，或含5.24荧光定量PCR检测阴性对照：V检测阴性对虾组织DNA，-20C以下保存. 有SpB、TcdB基因的质粒DNA，-20C以下保存.2
