NY
中华人民共和国农业行业标准
NY/T4524-2025
三七种子种苗腐皮镰刀菌检测方法
Detection method forFusarium solani inPanax notoginseng seeds and seedlings
中华人民共和国农业农村部 发布
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口.
本文件起草单位：中国农业科学院植物保护研究所、文山七麟三七科技有限公司.
本文件主要起草人：李园、曹坳程、王秋霞、颜冬冬、方文生、刘晓漫、张敏、吴佳佳、朱佳红、王麟猛.
三七种子种苗腐皮镰刀菌检测方法
1范围
本文件规定了三七（Panax notoginseng）种子和种苗中腐皮镰刀菌（Fusarium sofani）的检测方法，包括形态学检测方法（第一章）、PCR检测方法（第二章）和实时荧光定量PCR检测方法（第三章）.
本文件适用于三七种子和种苗中腐皮镰刀菌的检测.
2规范性引用文件
仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本 下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义.
4缩略谱
下列缩略语适用于本文件.
bp:碱基对（Base Pair)dNTP：脱氧核苷三磷酸（Deoxyribonucleoside Triphosphates)PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（CetyltrimethylAmmonium Bromide）Taq 酶:DNA 聚合酶(Taq DNA Polymerase) qPCR：实时荧光定量 PCR（Quantitative Real Time PCR)Ct:循环阔值（Cyele Threshold)
5腐皮镰刀菌基本信息
密绒毛状，菌丝有隔，分枝，分生孢子梗分枝或不分枝，分生孢子有2种形态，小型分生孢子卵圆形至柱形， 腐皮镰刀菌（Fusarium solani）属于瘤座孢科 Taberculariaceze 镰刀菌属Fusariaom 成员，菌落呈白色、细有1个～2个隔膜；大型分生孢子镰刀形或长柱形，有较多的横隔.腐皮镰刀菌其他信息见附录A.
6样品
6.1种子
种子外部检测，需随机选取100粒待检种子，放入灭菌的250mL三角瓶中，加人50mL无菌水后置于120r/min的摇床上，室温下充分振荡30min.吸取10mL悬浮液，于2000r/min的离心机中离心10min，弃去上清液，加入5mL.无菌水，充分振荡后吸取1mL悬浮液，用无菌水进行10倍系列梯度稀子，用无菌水冲洗3次，在培养Ⅲ底部铺上两层灭菌滤纸将种子倒人其中，用滤纸吸干种子表面的水分. 释至1000倍.种子内部检测，需随机选取100粒待检种子，在1%次氯酸钠溶液中浸泡10min，取出种如果进行PCR及gPCR检测，则将表面消毒后的上述种子置于灭菌后的研中，加人等质量无菌水，充分研磨制成组织研磨液.如果种子样品不能及时检测，保存温度应为15℃～18℃.
6.2种苗
送检三七种苗样品应为新鲜采集.称取根茎组织2g~3g，用75%乙醇浸泡30s，或者用1%次氯酸
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钠溶液浸泡5min，进行表面消毒，取出后在无菌水中清洗干净，晾干，置于灭菌后的研钵中，加入等质量无菌水，充分研磨制成组织研磨液，如果种苗样品不能及时检测，应放置于4℃保存.
第一章形态学检测方法
7仪器与设备
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他主要仪器与设备如下：
b）恒温培养箱. a）超净工作台：高效滤膜可除去99.99%以上的0.3pm粒子.c）全温摇瓶柜：40r/min~280r/min，5C~60C；d）高速台式离心机；最大转速≥10000r/min;×00~×02（af）微量移液器：100gL、1mL、5mL、10mL，并配备与移液器匹配的枪头.
8培养基
8.1马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）
称取马铃薯200g，去皮切成小块，加人1000mL去离子水中煮沸5min～10min，用纱布将马铃薯残
8.2Komada培养基
A组分的配制：氯化钾KCI1g、硫酸镁MgSO.1g、磷酸氢二钾K-HPO 2g、1-天冬碱L-Asparagine4 g、D-半乳糖 D-Galactose 40g、琼脂Agar 30g，加人1900 mL 蒸馏水，煮沸，分装于100 mL三角瓶，灭菌.
胆汁粉 Oxgall 1 g、五氯硝基苯 Pentachloronitrobenzene 1.5 g、硫酸链霉素Steptomycin sulfate 1 g，加人 B组分的配制：乙二胺四乙酸铁钠Fe-NaEDTA0.02g、十水合四硼酸钠NaB O10HO2g、牛100mL灭菌水，摇匀.
在无菌操作台中，向47.5mLA组分内加人2.5mLB组分，摇匀后均分倒人3个培养Ⅲ内.
9检测
9.1种子
9.1.1种子外部
吸取100μL6.1制得的悬浮液，均匀涂布于直径为9cm的PDA平板上，每个浓度梯度3次重复，相同条件下设无菌水空白对照.将涂布好的平板置于25℃恒温箱，黑暗条件下培养，3d～5d后观察.
9.1.2种子内部
箱，黑暗条件下培养，5d~7d后观察， 将按6.1处理后的种子均匀摆放在直径为9cm的PDA平板上，每Ⅲ10粒，共10Ⅲ，置于25℃C恒温
9.2种苗
在无菌条件下，用灭菌接种环蘸取6.2方法制备的组织研磨液涂布在Komada培养基上，每个样品3次重复，同时，涂板腐皮镰刀菌标准菌株菌悬液作为阳性对照.将涂布好的平板置于28C恒温箱，黑暗条件下培养，3d~5d后观察有无菌落形成及菌落特征.
10结果与判定
将分离到的真菌转移到PDA培养基进行纯化、镜检、转管保存.根据真菌培养性状和形态特征，参照《真菌鉴定手册x真菌学x植病研究方法》等工具书，通过观察菌株的菌落形态、菌丝和孢子形态特征进行菌株鉴定，真菌形态特征与5相符，可判定样品中存在腐皮镰刀菌.
