NY
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 4658-2025
动物源副猪嗜血杆菌分离与 鉴定技术规程
Technical code of practice for isolation and identification ofHaemophilusparasuisfrom animals
中华人民共和国农业农村部 发布
前言
本文件按照GB/T1.1-2020（标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由农业农村部畜牧兽医局提出.
本文件由全国兽药残留与耐药性控制专家委员会归口.
本文件起草单位：华中农业大学、中国兽医药品监察所、中国动物卫生流行病学中心、湖北省疾病预防控制中心、吉林大学、山东省滨州畜牧兽医研究院.
本文件起草人：郝海红、张纯萍、徐土新、何启盖、王鹤佳、黄安雄、赵琪、余波、黄玲利、蔡旭旺、徐晓娟、曲志娜、韩文瑜、顾敬敏、苗立中、王娟、张朋、阮紫涵、邹紫莹、张志浩、于学祥、孙琪、田野、杜鹏飞、陈玲、蒋额.
动物源副猪嗜血杆菌分离与鉴定技术规程
1范围
本文件确立了副猪嗜血杆菌（Haemophilasparasuis）分离与鉴定的程序，规定了样品采集与保存运输、分离纯化、筛查与鉴定、菌种保藏、生物安全要求的操作指示，描述了相应的试验方法.
本文件适用于动物源细菌耐药性监测对猪鼻腔拭子、肺脏、心包液、胸腔积液、腹腔积液、关节液和脑脊液等样品中副猪嗜血杆菌的分离与鉴定.
2规范性引用文件
仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本 下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件，文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T1948兽医实验室生物安全要求通则 GB/T34750副猪嗜血杆菌检测方法NY/T4141动物源细菌耐药性监测样品采集技术规程
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义.
4试剂或材料
4.1要求
配制或用商品化产品. 除另有规定外，试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的三级水，培养基按附录A的规定
4.2试剂
4.2.1胎牛血清.4.2.2烟酰胺腺原呤二核苷酸（NAD）.4.2.350×TAE缓冲液.4.2.4琼脂糖.4.2.5PCR预混液（2×PCR Master Mix).4.2.7甘油. 4.2.6荧光定量 PCR 预混液（2×SYBR Real-Time PCR Master Mix).
4.3.1NAD溶液：取NAD0.1g，加水适量使溶解并稀释至100mL 0.22pm无菌滤膜过滤.4.3.21×TAE缓冲液：取50×TAE缓冲液20mL 加水至1000mL4.3.31.2%琼脂糖凝胶：取琼脂糖1.2g，于100mL1×TAE中加热，充分溶解.4.3.4基质溶液：取α-氰-4-羟基肉硅酸（HCCA），按说明书配制，或用市售商品.4.3.5灭菌甘油：取甘油适量，121℃高压灭菌20min.
NY/T 4658-2025
4.4.1Cary-Blair氏运送培养基：按照附录A中A.1的规定执行.4.4.2TSA培养基（含0.1%NAD胎牛血清）：按照A.2的规定执行.4.4.3TSB珞养基（含0.1%NAD胎牛血清）：按照A.3的规定执行.4.4.45%蔗糖脱脂乳保护剂：按照A.4的规定执行.
副猪嗜血杆菌（Haemophiax paraxaix）[CVCC3894/CVCC3721/ATCC 19417].
4.6.1生化鉴定试剂盒或鉴定.4.6.2细菌DNA 提取试剂盒.4.6.3卡磁珠保藏管.4.6.4脱脂牛奶.4.6.50.22pm无菌滤膜.
5仪器设备
5.1二级生物安全柜.5.2冰箱：2℃~8C.-20C或以下.5.3分析天平：感量0.01g-5.4移液器：0.5 pl~1 000μl.5.5恒温培养箱.5.6微生物生化鉴定系统.5.7PCR仪.5.8高速冷冻离心机：离心速度≥12000r/min. 5.9核酸电泳仪.5.10电泳凝胶成像分析系统，5.11荧光定量PCR仪.5.12微生物质谱仪（MA1D1-TOF MS).5.13显微镜：10×~100×.
6分离鉴定程序
分离与鉴定程序见图1.
7样品采集与保存运输
按照NY/T4141的规定执行.
8分离纯化
无菌取鼻腔拭子、肺脏等样品涂布TSA培养基（含0.1%NAD胎牛血清）1/4范围用接种环划线，36C（士1C）培养24h~48h：用接种环取心包液、胸腔积液、腹腔积液、关节液、脑脊液等样品划线接种于TSA培养基（含0.1%NAD胎牛血清） 36C（±1C）培养24h~48h.
挑取单个圆形、光滑湿润、颜色灰白、边缘整齐、透明或半透明的针尖大小可疑菌落，接种TSA培养基（含0.1%NAD胎牛血清），36C（±1C）培养24h~48h，纯化备用.
