中华人民共和国国家标准
GB 4789.43-2016
食品安全国家标准食品微生物学检验微生物源酶制剂抗菌活性的测定
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 国家食品药品监督管理总局 发布
食品安全国家标准
食品微生物学检验 微生物源酶制剂抗菌活性的测定
1范围
本标准规定了微生物源酶制剂抗菌活性的测定方法.本标准适用于用微生物生产的酶制剂抗菌活性的测定.
2设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.2冰箱：2℃~5℃. 2.1生物安全柜.2.3恒温培养箱：36C士1℃2.4恒温水浴箱：46C士1℃.2.5天平：感量为0.1g.2.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头. 2.6振荡器.2.8无菌培养Ⅲ：直径90mm.2.9无菌锥形瓶：容量250mL、50mL.2.10pH计或精密pH试纸.2.11无菌纸片：见A.8. 2.12无菌镊子.2.13游标卡尺：刻度为0.1mm.
3培养基和试剂
3.1胰蛋白陈大豆琼脂（Tryptone Soy Agar TSA）：见A.1.3.2胰蛋白陈大豆肉汤（Tryptone Soy Broth，TSB)：见 A.2.3.3平板计数琼脂（Plate Count Agar）：见A.3.3.40.1 mol/L HCl:见A.4. 3.5无菌生理盐水：见A.5.3.650.Oμg/mL环丙沙星（Ciprofloxacin CIP）溶液：见A.63.75.0μg/片环丙沙星纸片：见A.7.
4试验菌株
4.1金黄色葡萄球菌（Staphylococcus αureus）ATCC 6538.
4.2大肠埃希氏菌（Escherichia cofi）ATCC 11229.4.3蜡样芽胞杆菌（Bacillas cerens）ATCC 2.4.5化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）ATCC 12344. 4.4环状芽孢杆菌（Bacilluscirculans）ATCC45164.6粘质沙雷菌（Serraria marcescens）ATCC 14041.
5检验程序
微生物源酶制剂抗菌活性的测定检验程序见图1.
图1微生物源酶制剂抗菌活性的测定检验程序
6操作步骤
6.1试验菌悬液原液制备
将金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、大肠埃希氏菌（ATCC11229）、蜡样芽孢杆菌（ATCC2）、环状芽孢杆菌（ATCC4516）、化脓性链球菌（ATCC12344）、粘质沙雷菌（ATCC14041）冻存菌株分别接种于
盛有5mLTSB的试管，置36℃士1℃培养18h～24h进行第一次传代培养，分别挑取第一次传代培液原液备用.
试验菌悬液原液纯度检测：分别挑取试验菌悬液原液各一环，划线接种于TSA平板，36C士1℃培养20h~24h，观察纯度.
6.2菌悬液原液浓度测定
6.2.1菌悬液原液稀释
分别取6.1中制备的菌悬液原液依次进行十倍梯度稀释，蜡样芽孢杆菌和环状芽孢杆菌分别制成10一稀释液，金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、化脓性链球菌、粘质沙雷菌分别制成10一稀释液.
6.2.2培养计数
分别吸取6.2.1中制备好的各菌稀释液1mL于无菌平Ⅲ内，每个稀释度做两个平行，并用无菌生理盐水作空白对照.向平Ⅲ中倾注冷却至46℃左右（可放置于46℃士1C的恒温水浴箱中保温）的平 板计数琼脂15mL～20mL，并转动平血使其混合均匀.待琼脂凝固后，将平板翻转，于36C士1C培养24h后计数，各菌悬液原液中菌浓度均大于10CFU/mL时方可使用.
6.3检测平板制备
倾注融化并冷却至46C士1C的TSA培养基15mL于无菌培养Ⅲ内，待其凝固后制成TSA平板，备用.
将6.1中二次传代后的各菌培养物分别用冷却至46C士1℃的TSA培养基按1：10的比例稀释
注：为防止含菌培养基遇到TSA后马上凝国引起菌悬液铺板不均匀菌悬液铺板前应事先将TSA平板置于46℃士
1℃条件下保温平衡10 min.
6.4酶制剂纸片的制备
准确称（移）取1.0g（mL)酶制剂于9mL无菌生理盐水中，充分混匀后制成10%的酶制剂溶液.将无菌纸片放人无菌平Ⅲ内，在每张纸片上缓缓滴加100gL10%的酶制剂溶液，使其全部吸收，每种酶制剂样品制备12张纸片.
6.5贴纸片及培养
将6.4中制备的含待测酶制剂的纸片、含环丙沙星的阳性对照纸片（见A.7）和含100pL无菌生理盐水的空白阴性对照纸片用无菌镊子分别置6.3中制备的检测平板上，每个平板贴2张纸片（2张含待测酶制剂的纸片或2张含环丙沙星的纸片或2张空白纸片）.两纸片圆点的间距大于32mm，每个标准 菌株分别设一阳性对照和一阴性对照平板.将平板正置于4℃C士0.5℃冰箱内过夜（12h~16h）.第二天转人36C士1C恒温培养箱中培养24h后，测定酶制剂样品、环丙沙星和阴性对照纸片形成的抑菌周.
7抗菌活性结果报告
7.1结果判定
若待测酶制剂对3种或3种以上受试微生物呈现出抗菌活性，即纸片周围出现清晰可见的抑菌圈
