中华人民共和国国家标准
GB 5009.309-2025
食品安全国家标准
中华人民共和国国家卫生健康委员会 国家市场监督管理总局 发布
食品安全国家标准
食品中天冬酰胺和谷氨酰胺的测定
1范围
本标准规定了食品中天冬酰胺和谷氨酰胺测定的柱前行生-高效液相色谱法和液相色谱-申联质谱法.
第一法中直接提取法适用于特殊膳食用食品中游离态天冬酰胺和游离态谷氨酰胺的测定，酶解提取法适用于特殊膳食用食品中天冬酰胺总量和谷氨酰胺总量的测定.
第二法适用于特殊膳食用食品中天冬酰胺总量和谷氨酰胺总量的测定.
第一法柱前衍生-高效液相色谱法
2原理
试样经直接提取或灰色链霉菌蛋白酶酶解，天冬酰胺和谷氨酰胺与丹磺酰氯进行衍生反应，衍生物经C柱分离，紫外检测器检测，外标法定量.
3试剂和材料
除另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水，
3.1试剂
3.1.1甲醇（CHO）：色谱纯. 3.1.2乙晴（CHN）：色谱纯.3.1.3丹磺酰氯（CHCINOS）.3.1.4无水碳酸钠（NaCO）.3.1.5无水磷酸氢二钠（NaHPO）3.1.6盐酸甲胺（CHNHC1). 3.1.7三羟甲基氨基甲烷（Tris碱，CHON）.3.1.8灰色链霉菌蛋白酶（XIV型；来源于灰色链霉菌）：酶活力≥3.5U/mg.3.1.9磷酸（HPO）：色谱纯，含量≥85%.3.1.10浓盐酸（HCI).
3.2试剂配制
3.2.1丹磺酰氯溶液（2.0g/L）：称取0.2g丹磺酰氯用乙晴溶解并定容至100mL，现配现用.3.2.2盐酸溶液（1.0mol/L）吸取8.3mL浓盐酸，加水稀释至100mL.3.2.3Tris缓冲液（0.05mol/L)；称取6.06g三羟甲基氨基甲烷于1000mL烧杯中，加水800mL溶解，用1.0mol/L盐酸溶液调节pH至8.0土0.1，用水稀释至1000mL.4℃保存，有效期1个月.
GB 5009.309-2025
3.2.4蛋白酶溶液（52.5U/mL）：称取0.15g灰色链霉菌蛋白酶用Tris缓冲液溶解并定容至10mL.现配现用.3.2.5碳酸钠缓冲溶液（60mmol/L)：称取0.318g无水碳酸钠，加40mL水溶解，用1.0mol/L盐酸3.2.6盐酸甲胺溶液（20g/L）：称取2.0g盐酸甲胺，用水溶解并定容至100mL.4℃保存，有效期 溶液调pH至9.5土0.1.用水定容至50mL.现配现用.3个月.3.2.7磷酸氢二钠溶液（10mmol/L）：称取无水磷酸氢二钠1.42g用800mL水溶解，用磷酸调节pH至6.5土0.1，用水稀释至1000mL.3.2.820%甲醇溶液：量取20mL甲醇，加水稀释至100mL.
3.3标准品
3.3.1天冬酰胺标准品（CHNO，CAS号：70-47-3）：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证3.3.2谷氨酰胺标准品（CHNO，CAS号：56-85-9）：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证 书的标准品.书的标准品.
3.4标准溶液配制
3.4.1天冬酰胺标准储备液（2.00mg/mL）：准确称取100mg（精确至0.0001g）天冬酰胺标准品，用20%甲醇溶液溶解并定容至50mL.4C避光保存，有效期3个月.3.4.2谷氨酰胺标准储备液（2.00mg/mL）：准确称取100mg（精确至0.0001g）谷氨酰胺标准品，用3.4.3混合标准中间液（20.0μg/mL）：分别准确吸取天冬酰胺和谷氨酰胺标准储备液各1.00mL于 20%甲醇溶液溶解并定容至50mL.4C避光保存，有效期3个月.100mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，现配现用.3.4.4混合标准系列工作液：分别准确吸取适量混合标准中间液（20.0μg/mL）于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，获得质量浓度分别为0μg/mL、0.500μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/ml、5.00μg/mL、 10.0μg/mL和20.Og/mL的标准系列工作液，现配现用.
牌9'
3.5.2有机微孔滤膜：0.22pm. 3.5.1螺纹带盖玻璃瓶：20ml.
4仪器和设备
4.2电子天平：感量0.001g和0.0001g. 4.1高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器.4.3涡旋混合器.4.4恒温水浴装置：37C土1℃C4.6离心机：转速≥5000r/min 4.5pH计：精度0.01.
5分析步骤
5.1试样制备
非粉状固体试样粉碎并混合均匀，粉状固体试样或液体试样摇匀.2
5.2试样提取
5.2.1直接提取法
固体试样称取5.0g（精确至0.001g）于50mL干燥烧杯中，加适量湿水（40℃C~45C）溶解，冷却至室温后转移并定容至25mL.准确移取1.00mL于150mL锥形瓶中，加人约25mL水涡旋混匀，用1.0mol/L盐酸溶液调节pH至4.5士0.1，然后转移至250mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，离心或者过滤得到待衍生试样溶液.
液体试样称取1.0g~5.0g（精确至0.001g）于150mL锥形瓶中，后续操作步骤同固体试样.
5.2.2酶解提取法
固体试样称取5.0g（精确至0.001g）于50mL干燥烧杯中，加适量温水（40℃~45“C）溶解，冷却白酶溶液、3.0mLTris缓冲液、0.2mL甲醇，涡旋混匀，于37C恒温水浴酶解16h.取出玻璃瓶，冷却 至室温后转移并定容至25mL，准确移取1.00mL于20mL螺纹带盖玻璃瓶中，依次加人0.5mL蛋至室温，将酶解液全部转移至250mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀.离心或者过滤得到待衍生试样溶液.
液体试样称取0.5g~1.0g（精确至0.001g）于20mL螺纹带盖玻璃瓶中，后续操作步骤同固体试样.
5.3衍生反应
准确吸取待衍生试样溶液1.00mL至15mL离心管中，加人1.00mL碳酸钠缓冲溶液和1.00mL丹磺酰氯溶液，充分混合，室温避光反应2h（反应约1h时取出振摇均匀），加人0.10mL盐酸甲胺溶液 涡旋混合，终止反应，避光静置至沉淀完全，经0.22μm滤膜过滤，待测.
另准确吸取1.00mL混合标准系列工作液，与待衍生试样溶液同步进行衍生.
5.4仪器参考条件
色谱参考条件如下：
a）色谱柱：C色谱柱（250mm×4.6mm，5gm）或性能相当者；b）流动相A为10mmol/L磷酸氢二钠溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件见表1；c）流速：1.0 mL/min;d）柱温：35℃；f）进样量：10gL e）检测波长：247nm;
表1梯度洗脱条件
时间/min 流动相A/% 流动相 B/ %0 0 7017 0 70 3017.1 19 0 20 20 08 0819.1 70 3024 0 70 30
5.5标准曲线的制作
将衍生后的混合标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪中，以混合标准系列工作液中天冬酰胺或谷氨酰胺的质量浓度为横坐标，以天冬酰胺衍生物或谷氨酰胺衍生物的峰面积为纵坐标，分别绘制标准曲线.标准溶液衍生后的色谱图见附录A中图A.1.
5.6试样溶液的测定
将行生后的待测液注人高效液相色谱仪中，得到相应的峰面积，根据标准曲线得到试样溶液中天冬酰胺或谷氨酰胺的质量浓度.待测液中目标化合物的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围 则应对待衍生试样溶液进行稀释，重新按样品衍生分析步骤处理后再进样分析.
5.7空白试验
除不加试样外，其他操作与样品的操作一致.
6分析结果的表述
6.1游离态天冬酰胺和游离态谷氨酰胺
直接提取法试样中游离态天冬酰胺、游离态谷氨酰胺的含量按公式（1)计算：
式中：
X 试样中游离态天冬酰胺、游离态谷氨酰胺的含量，单位为毫克每克（mg/g）：P 由标准曲线得到的试样溶液中天冬酰胺、谷氨酰胺的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/V 一试样最终定容体积，单位为毫升（mL）； mL);f -稀释因子；试样质量，单位为克（g）；1000单位换算系数.计算结果保留3位有效数字.
6.2天冬酰胺总量和谷氨酰胺总量
酶解提取法试样中天冬酰胺总量、谷氨酰胺总量按公式（2）计算：
式中：
X -试样中天冬酰胺总量、谷氨酰胺总量，单位为毫克每克（mg/g）：P 由标准曲线得到的试样溶液中天冬酰胺、谷氨酰胺的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/ mL);P 一由标准曲线得到的空白试验溶液中天冬酰胺、谷氨酰胺的质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL) ;V 试样最终定容体积，单位为毫升（mL）；f 稀释因子； 试样质量，单位为克（g）；
