NY/T 3641-2020 欧洲甜樱桃品种鉴定 SSR分子标记法.pdf
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ICS 65.020.01 B 05
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 3641-2020
欧洲甜樱桃品种鉴定 SSR分子标记法
Identification of sweet cherry varieties using SSR marker method
中华人民共和国农业农村部发布
目次
1范围 前言2规范性引用文件3术语和定义4仅器设备及试剂5溶液配制 6引物相关信息及使用7参照品种及使用8操作程序9数据记录与统计10判定方法 附录A（规范性附录） 仅器设备及试剂附录B（规范性附录） 溶液配制.附录C（规范性附录）核心引物名单及序列附录D（资料性附录）核心引物相关信息
全国农食品标准本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草.本标准由农业农村部种业管理司提出. 机构不承担识别这些专利的责任.本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277）归口.本标准起草单位：中国农业科学院郑州果树研究所.本标准主要起草人：李明、刘聪利、齐希梁、李玉红、宋露露.
欧洲甜樱桃品种鉴定 SSR分子标记法
1范围
本标准规定了利用简单重复序列（Simple soquence repcat SSR）标记的遗传多态性进行欧洲甜樱桃（PrunusaviumL）品种鉴定的操作程序、数据记录与统计、判定规则.
本标准适用于欧洲甜樱桃品种的SSR指纹数据采集及品种鉴定.
RD凡是不注日期的引用文件， 下列文件对于本文件的应 活的 的 改版理 艾注 期的版本适用于本文件.
NY/T 2594NY/T 3056 植物 性和稳定性测试指南
品种分子鉴定 定优先进 品种DNA指纹数据采集和品种鉴 3.2参照品种
CENTER对应于特定位 位变异扩增片段的大小，校正仪馨设 备的系 R
见附录A.
5溶液配制
见附录B.
6引物相关信息及使用
核心引物名单及序列见附录C，核心引物相关信息见附录D.
7参照品种及使用
参见附录D.
8操作程序
8.1样品制备
每个品种检测3个单株，进行混样分析.当一致性结果较差时，进行单独取样分析.
采用CTAB法.选取欧洲甜樱桃幼嫩叶片或芽（0.2g左右）在液氮中研磨至粉末，迅速将粉末移人
NY/T 3641-2020
2.0mL离心管；每管加人700uL65C预热的2%CTAB缓冲液，轻摇混匀：65C水浴30min，期间多次颠倒混匀以确保充分裂解.于4C12000g离心10min；取上清液，每管加人等体积的氯仿-异戊醇（24： 1）混合液，充分混匀后，12000g离心10min；取上清液到新的2mL离心管中，再加入1mL-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀沉淀DNA，并于一20C条件下放置30min以上，于4C12000g离心15min，弃上清液；用75%乙醇浸泡清洗沉淀2次，风干，将沉淀物溶解于200gL灭菌超纯水中，使用核酸蛋白浓度测定仪进行浓度测定，一20C保存备用.
注：以上为推荐的一种DNA提取方法.所获DNA质量能够符合PCR扩增需要的DNA提取方法都适用于本标准.
8.3PCR扩增
8.3.1引物选择
选择附录C中17对引物进行检测.
8.3.2反应体系
mmol/L)、正反向引物各0.4 μL(10μmol/L)，Taq 酶0.2μL（5U/gL)，灭菌超纯水6.2L，在PCR 扩增仪上进行扩增.
利用毛细管电泳荧光检测时使用荧光标记的引物，引物的荧光染料种类参见附录D.
注：反应体系的体积可以根据具体的情况进行调整.
8.3.3反应程序
95℃预变性5min；95℃变性30s 57℃退火30s 72℃延伸1min，共35个循环；72℃下延伸10min，4C保存.
8.4PCR产物检测
8.4.1普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)检测
8.4.1.1清洗玻璃板
将玻璃板清洗干净，用去离子水冲洗后晾干.用无水乙醇擦洗2遍，吸水纸擦干.在长板上涂0.5mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作液.操作过程中防止2块玻璃板互相污染.
8.4.1.2组装电泳板
待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平.
8.4.1.3制胶
在60mL6.0%PAGE胶液中分别加人600pL10%的过硫酸铵和60gLTEMED，轻轻混匀后，灌胶.灌胶过程中防止出现气泡.待胶液完全充满玻璃板夹层，将0.4mm厚鲨鱼齿梳齿平齐端向里轻轻插人胶液约0.4cm，胶液在室温下聚合1h以上.胶聚合后，清理胶板表面溢出的胶液，轻轻拔出梳子，用水清洗干净备用.
8.4.1.4预电泳
将胶板安装于电泳槽上，在正极槽（下槽）中加人1×TBE缓冲液约800mL，在负极槽（上槽）加人预热至65℃的1×TBE缓冲液约800mL.在85W恒功率下，预电泳10min~20min.
8.4.1.5样品制备
于冰上. 在10gLPCR产物中加人2pL6X加样缓冲液，混匀后，在PCR仪上95C变性5min，取出，迅速置
8.4.1.6电泳
用移液器吹吸加样槽，清除气泡和杂质.将鲨鱼齿梳子梳齿端插人凝胶1mm～2mm.每一个加样孔点人2pL~4uL扩增产物，在胶板两侧点人DNAMarker.除待测样品外，还应同时加人参照品种的扩增产物.以30V/cm~40V/cm的电压电泳，使凝胶温度保持在约50℃.电泳时间1.5h~2.5h（电 泳时间取决于扩增片段的大小范围）.
8.4.1.7银染显色
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库七七