中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
牛脊椎畸形综合征TaqMan探针PCR 检测方法
Detection method for bovine plex vertebral
malformation by TaqMan PCR
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.
请注意本文件的某些内容有可能涉及专利.本文件的发布机构不应承担识别这些专利的责任.
本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、国家质量监督检验检疫总局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：吴晓薇、刘中勇、贾广乐、彭小莉、陈茹、朱道中、鱼海琼、刘志玲、段燕瑜、林志雄.
牛脊椎畸形综合征TaqMan探针PCR 检测方法
1范围
本标准规定了牛脊椎畸形综合征（参见附录A）TaqMan探针PCR的检测方法.本标准适用于快速筛查牛群中隐性牛脊椎畸形综合征基因携带者.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3缩略语
下列缩略语适用于本文件：
CVM脊椎畸形综合征（ComplexVertebral Malformation）TagMan 探针TaqMan 探针（TaqMan probes)PCR聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）Ct值荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数（Cyelethreshold）SNP单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism）
4原理
TagMan法的SNP分型检测技术的原理：在普通聚合酶链反应的基础上时.加人一对两端有不同荧光标记的特异性探针来识别不同的等位基因（allelel和allele2）.5'端为报告荧光基团（reporter），3端为淬灭荧光基团（qucncher）.两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异性退火结 合.当探针以完整形式存在时由于能量共振转移，荧光基团只发出微璃荧光；当特异的探针与相应的等位基因杂合后，DNA聚合酶发挥5'到3'外切酶活性，荧光报告基团被切割下来，股离了3'端萍灭荧光基团的率灭作用（quench）从面发出荧光信号.根据检测到荧光信号的不同，可以判断相应样本的SNP等位基因型.
5仪器设备和试剂耗材
5.1仪器与设备
荧光定量PCR仪.台式冷冻离心机（转速可达到12000r/min）. 恒温水浴锅.
SN/T 4821-2017
涡混匀器.冰箱（2℃~8℃、-20℃、-80℃）.微量可调移液器（10μL、100gL、1000uL）及配套吸嘴.Ⅱ级生物安全柜.
5.2试剂与耗材
5.2.1试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯
5.2.3饱和酚和异丙醇：分析纯，使用前预冷至一20
5.2.6荧光PCR试剂盒.
5.2.710%SDS：配制方法见附录B.
5.2.8阳性对照为采集阳性牛的血液样品，阴性对照为采集国性牛的血液样品，均保存于一20℃备用.
6引物与探针序列
扩增序列参见附录C
采用DEPC水将每条引物和探针配制成100mo/L缺存液，置一20 C或更低温度冻存：使用时取适量配制成10μmol/L工作液，避免多次冻.
7样品采集、保存及运输
采集牛的抗凝血，冷藏储存与运
8DNA提取
8.1将血液样品200xL，加人2mL塑料离心管中，加20pL蛋白酶K.再加10%SDS20pL，混匀.
8.2混合液置于55C水浴2.5h.
8.3向勾浆液中按1：1比例加酚/三氧甲烷/异戊醇混合液（25：24：1）.轻轻震荡5min后12000r/min离心5min.
8.4吸上层水相400pL于一灭菌塑料离心管中，再次加人等体积酚/三氯甲烷/异戊醇混合液，轻轻震荡混匀5min.12000r/min离心5min，
8.5吸上层水相500pL于一塑料离心管中.加人两倍体积的无水乙醇，-20C放置2h；12000r/min离心5min，倾去上清液.
8.6向DNA沉淀中加人75%乙醇溶液500pL，轻轻混匀后12000r/min离心5min，倾去上清液，室温凉干.
注：DNA提取也可以采用等效组织DNA提取试剂盒，按照说明书进行.
9TagMan探针PCR检测
9.1设立对照
从样品处理开始，应设置对照.
以CVM的野生型（G/G型）的DNA作野生型对照：以杂合型（G/T型）的DNA作杂合型对照：以突变型（T/T型）的DNA为纯合型对照：以灭菌双蒸水作阴性对照.
9.2Taqman探针PCR的反应体系（25μL）
反应体系：体积为25μL.包括实时荧光PCR反应混合液12.5μL（DNA聚合酶1U~2U，荧光PCR缓冲液，MgSO2.5mmol/L~4. mmol/1.dNTP0.25mmol/L RoX染料o.4mmol/L）.-对引物各1pl，一对探针各1pL.DNA模板2μL，加双蒸水补至25l
9.3荧光PCR反应
荧光素设定：ReportDye设置为FAM和VIC.Quen Dye都设定为BHQ，ReferenceDye设定为None.
第一阶段，预变性94℃3min;
第二阶段，扩增94C30s.60 C30s.72C30s，40个循环
荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行，试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和C：值判定结果，
9.4结果判定
9.4.1质控对照判定
野生型（G/G型）对照样品：出现一条扩增曲线.为FAM的典型扩增曲线；Ct值小于30.
突变型（T/T型）对照样品：出现
空白对照：应无曲线出现，Ct值显示为None（参见附录 D.牛脊推畸形综合征的TaqMan探针PCR检测参考图谱）.
质控对照不出现上述结果视为本次实验无效.
9.4.2样品结果判定
在质控有效的条件下进行结果判定.
检测样品出现一条FAM探针扩增曲线，且C值≤30.则样品判定为CVM野生型（G/G型）阳性 检测样品出现一条VIC探针扩增曲线，且C：值≤30，则样品判定为CVM突变型（T/T型）阳性.
若待检样品出现特征性扩增出上述任一条曲线C：值介于30和35之间时，应重新进行实时荧光PCR检测，若则重新检测的Ct值仍介于30和35之间，则可以根据扩增出的曲线对照质控参考图谱判断阳性类型.若重新检测的结果中C：值≥35时，无法判断实验结果.可以选择其他检测方法，或重 新采集该牛的血液样品进行检测.
