实验动物 仙台病毒PCR检测方法
Laboratory animal - PCR method for deteetion of Sendai virus
中国实验动物学会发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则编写.本标准由中国实验动物学会归口. 本标准附录为规范性附录.本标准由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查.本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草.本标准主要起草单位：广东省实验动物监测所.本标准主要起草人：李、黄韧、王静、袁文、张钰、吴瑞可.
实验动物仙台病毒PCR检测方法
1范围
本标准规定了仙台病毒普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法.
本标准适用于实验动物怀疑本病发生，实验动物接种物、实验动物环境和动物源性生物制品中仙台病毒的检测.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注明日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T14926.23-2001《实验动物仙台病毒检测方法》GB19489《实验室生物安全通用要求）
GB/T19495.2《转基因产品检测实验室技术要求》
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适合于本标准.
3.1.1
聚合酶链反应polymerase chainreaction，PCR
体外酶催化合成特异DNA片段的方法：模板DNA先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火面相互结合，接着在DNA聚合酶的作用下以四种dNTP为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片 段以几何倍数扩增.
3.1.2
逆转录-聚合酶链反应reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR
以RNA为模板，采用Oligo（dT）、随机引物或特异性引物，RNA在逆转录酶和适宜反应条件下，被逆转录成cDNA，然后再以cDNA作为模板，进行PCR扩增.
3.1.3
实时荧光逆转录-聚合酶链反应real-timeRT-PCR，实时荧光RT-PCR
实时荧光RT-PCR方法是在常规RT-PCR的基础上，在反应体系中加入特异性荧光探针，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，通过检测每次循环中的荧光发射信号，间接反映PCR扩增的目标基因的量，最后通过扩增曲线对未知模板进行定性或定量分析.本
228第三箱实验动物检测方法系列标准
免名称混淆.
3.1.4
Ct值cycle threshold
实时荧光PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本标准.DEPC焦碳酸二乙酯diethylpyrocarbonate CPE细胞病变效应cytopathiceffectDNA脱氧核糖核酸deoxyribonucleicacidPBS磷酸盐缓冲液phosphatebuffered salineRNA 核糖核酸ribonucleicacidSV仙台病毒Sendai virus
4检测方法原理
根据仙台病毒保守序列L蛋白基因，设计合成一对普通RT-PCR引物，同时根据M蛋白基因，设计合成一对特异性引物和一条特异性探针.用合适的方法提取样本中的病毒RNA，通过逆转录酶将病毒RNA逆转录成cDNA，分别通过特异引物和探针进行PCR和 实时荧光PCR，根据RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测结果判定该样品中是否含有病毒核酸成分.
PCR的基本工作原理是：以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5'端和3端互补的赛核苷酸片段为引物（primcr），在耐热DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA分子合成.重复这一过程，即可使目的DNA片 段得以大量扩增.实时荧光PCR设计合成一对特异性引物和一条特异性探针，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个辩灭荧光基团.探针完整时，报告基团发射的荧光信号被辩灭基团吸收；PCR扩增时，Tag酶的5'→3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生并被检测仪器接受，随着PCR反应酸模板进行检测. 的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈对应关系.因此，可以通过检测荧光信号对核
5主要设备和材料
5.1实时荧光PCR仪.5.2PCR仪.5.3电泳仪. 5.4凝胶成像分析系统.5.5Nanodrop紫外分光光度计.5.6高速冷冻离心机5.7台式离心机.
5.8恒温孵有器.5.9涡旋振荡器. 5.10组织匀浆器或手持式均质器.5.11生物安全柜.5.12PCR工作台.5.13-80℃冰箱，-20℃冰箱，2~8℃冰箱.5.14微量移液器（10gL，100pL，1000μL）. 5.15无RNase和DNase污染的离心管（1.5mL，2mL，5mL，15mL），无RNase和DNase 污染的吸头（10μL，200uL，1mL），无RNase和DNase 污染的0.2mLPCR扩增反应管.5.16采样工具：剪刀、镊子、注射器等.
6试剂
除特别说明外，实验用试剂均为分析纯；实验用水为去离子水.6.1灭菌PBS.见附录A.6.2无DNasc/RNase去离子水：经DEPC处理的去离子水或商品无DNase/RNasc水.见附录A. 6.3RNA抽提试剂TRIzol或其他等效产品.6.4无水乙醇.6.575%乙醇（无DNase/RNase去离子水配制）.6.6三氯甲烷（氯仿）.6.7异丙醇. 6.8逆转录试剂：PrimeScriptRTreagentKit，也可以使用其他公司等效逆转录试剂.6.9普通PCR试剂：PremixTaq°Version 2.0（Loading dyemix）或使用其他等效试剂.6.10DNA分子质量标准.6.11TAE电泳缓冲液.见附录A.6.12澳化乙锭：10mg/mL，配制方法见附录A；或其他等效产品. 6.131.5%琼脂糖凝胶，配制方法见附录A.6.14实时荧光PCR试剂：PrimerscriptRT-PCRKit（Perfect Realtime），或其他等效产品.6.15引物和探针：根据表1和表2的序列合成引物和探针，引物和探针加无RNase去离子水配制成10μmol/L和5umol/L储备液，-20C保存.
表1普通RT-PCR扩增引物
引物名称 引物序列（5→3'） 产物大小bp正向引物 ATGAAGGACAAAGCATTATCGCCTA 180反向引物 CAACCAGTCTCCTGATTCCACGTA
