中华人民共和国国家标准
GB/T 22973-2008
牛奶和奶粉中醋酸美仑孕酮、 醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮 残留量的测定液相色谱-串联质谱法
Determination of melengestrol acetate，chlormadinone acetate and megestrolacetate residues in milk and milk powderHPLC-MS-MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口.
本标准负责起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：王传现、唐毅锋、方晓明、盛永刚、庞国芳.
牛奶和奶粉中醋酸美仑孕酮、 醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮 残留量的测定液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了牛奶和奶粉中醋酸美仑孕酮（melengestrolacetate）醋酸氯地孕酮（chlormadinoneacetate）和醋酸甲地孕酮（megestrolacetate）残留量的液相色谱-中联质谱测定方法.
本标准适用于牛奶和奶粉中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮残留量的测定.
本标准的方法检出限：牛奶中醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮检测限均为2μg/kg：奶粉中醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮的检测限均为20pug/kg.
2规范性引用文件
的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 12004 IS 5725-1:1994 IDT)
性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT） GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987 MOD)
3原理
从牛奶样品中提取脂肪后，用乙躺提取，皂化后，经氰丙基型固相萃取柱净化，C色谱柱分离，液相色谱-中联质谱检测，外标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯.
4.1水：GB/T6682，一级.4.2乙睛：色谱纯.4.3甲醇：色谱纯.4.4乙酸乙酯：色谱纯.4.5正已烷：色谱纯. 4.6氯化镁（MgCl:6HO）.4.7氢氧化钠.4.8甲酸.4.925%氨水， 4.1095%乙醇.4.11石油醚.4.12无水硫酸钠.
4.14乙酸乙酯正已烷（14）量取40mL乙酸乙酯（4.4）与160mL正已烷（4.5）混合.4.151.0mol/L氯化镁溶液：称取20.3g氯化镁（4.6），用水溶解并定容到100mL. 4.160.1mol/L氢氧化钠溶液：称取1.00g氢氧化钠（4.7），用水溶解并定容到250mL.4.17乙晴水（73）：量取700mL乙晴（4.2）与300mL水混合，摇匀.4.18标准物质：醋酸美仑孕酮、酷酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮，纯度≥97%.4.191000μg/mL标准储备溶液：准确称取醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准物质 （4.18）各0.0500g于50mL容量瓶中，用甲醇（4.3）溶解并定容至刻度.标准储备溶液于4C保存.4.20100μg/mL混合标准溶液I.分别吸取10.0ml醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准储备液（4.19）于100mL容量瓶中，用甲醇定容.该混合标准溶液于4C保存.4.211.0μg/mL混合标准溶液Ⅱ，取1.0mL混合标准溶液I（4.20）于100mL容量瓶中.用甲醇定容.该混合标准溶液于4C保存. 4.22基质混合标准工作溶液：根据需要，取适量的混合标准溶液Ⅱ（4.21），用空白样品提取液配成不同浓度的基质混合标准溶液.标准工作溶液现用现配.4.23氰丙基固相萃取柱或相当者：3mL/500mg.使用前分别用5mL乙酸乙酯和6mL正已烷淋4.24滤膜：0.2 um. 洗，保持柱体湿润.
5仪器和设备
5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g. 5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）.5.3氮气浓缩仪.5.4固相萃取装置：配有真空泵.5.5低温离心机：一5C至室温，最大转速5000r/min，5.7恒温水浴. 5.6液体混匀器.5.8微波炉.5.9移液器:10 yuL~100 μL 和 100 μL~1 000 pl.
6试样制备与保存
6.2试样的保存 如果制备好的试样不立刻测定，则将测试样置于4C中保存.
7测定步骤
加1.0mL氨水（4.9），混匀.加人10mL95%乙醇（4.10），混匀后加入10mL乙酸乙酯（4.4），振摇1min，再加入10mL石油醚（4.11)，同样振摇1min，以4000r/min离心5min，吸取上层提取液通2
过装有15g无水硫酸钠的玻璃柱过滤到50mL具塞聚丙烯离心管中.再用8mL乙酸乙酯（4.4）和8mL石油醚（4.11）重复提取残液一次.以4000r/min离心5min，提取液过相同的无水硫酸钠的玻璃柱，用5mL乙酸乙酯淋洗无水硫酸钠柱后，合并提取液，提取液于60C用氮气浓缩仪吹干.
加人5mL乙晴，于60C水浴中保持3min，使脂肪融化.误旋1min，于-5C以4000r/min离上清液.向合并的乙晴提取液中加人2mL正已烷（4.5），涡旋1min，于一5C以4 000r/min离心5min，弃去正已烷层，再用2mL正已烷重复洗涤乙睛相，弃去正已烷层.乙睛提取液于60C用氮气 浓缩仅吹于.
7.3皂化
向乙睛提取液（7.2）中依次加人4mL正已烷（4.5）、1mL氢氧化钠溶液（4.16）和0.5mL氯化镁5min，吸取上清液至15mL离心管中.向沉淀物中再加人4mL正已烷，混匀，于60C水浴中加热 溶液（4.15），于液体混匀器上快速混勾10s，在60C水浴中保持15min，于-5C以4000r/min离心15min后，于一5C以4 000x/min离心5min，合并上清液.于60C用氮气浓缩仪吹干，用1.0mL正已烷溶解残渣，待净化.
7.4净化
移人固相萃取柱中.待样液流出后，依次用5mL正已烷和6mL乙酸乙酯正已烷溶液（119） 将上述样液（7.3）移人氰丙基固相萃取柱中（4.23），用2mL正已烷分两次润洗玻璃试管，洗液也（14）（4.14）洗脱，洗脱液收集于另一15mL离心管中，于60C用氨气浓缩仪吹干.残余物用1mL乙晴水（73）（4.17）涡旋溶解，过滤膜，供液相色谱-串联质谱测定.
7.5测定条件
7.5.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
a）色谱柱：C柱，3μm，50mm×2.0mm（内径）或相当者； b）柱温：30C；c）流速：0.3mL/min;d）进样量：10gL;e）梯度洗脱，洗脱程序见表1.
表1液相色谱梯度洗脱程序
时间/min 0.1%甲酸水溶液/% 乙婧含0.1%甲酸/%0 9) 101 0 20 807.0 20 808 0 90 10
7.5.2质谱参考条件
质谱参考条件如下：
a）离子源：正离子电喷雾：b）扫描方式：多反应检测MRM；c）电喷雾电压：4000V；e）雾化气、气帘气、辅助气：均为高纯氮气，使用前调节各气流流量，以使质谱仪灵敏度达到检测 d）离子源温度：350C；要求；i）定性离子对，定量离子对，去簇电压和碰撞能量见表2.
