中华人民共和国国家标准
GB/T 22975-2008
牛奶和奶粉中阿莫西林、氨苄西林、哌拉 西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、 氯唑西林、萘夫西林和双氯西林 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Determination of amoxicillinampicillinpiperacillin penicillin GpenicillinV oxacillin，cloxacillin，nafcillin dicloxacillinresiduesin milk and milk powder-LC-MS-MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口.
本标准负责起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：段文仲、贾海涛、艾连峰、陈瑞春、郭春海、马育松、刘宝圣、崔奕杰、庞国芳.
牛奶和奶粉中阿莫西林、氨苄西林、哌拉 西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、 氯唑西林、萘夫西林和双氯西林 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了牛奶和奶粉中阿莫西林、氨苄西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西
林、奈夫西林和双氯西林残留量的高效液相色谱-申联质谱测定方法.
本标准适用于牛奶和奶粉中阿莫西林、氨苄西林、啄拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、奈夫西林和双氯西林残留量的测定和确证.
本标准的方法检出限：牛奶中氨苄西林、奈夫西林为1pg/kg，阿莫西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、氯唑西林为2ug/kg，苯唑西林、双氯西林为4μg/kg；奶粉中氨苄西林、奈夫西林为8pg/kg，阿莫西林、拉西林、青霉素G、青霉素V、氯唑西林为16μg/kg，苯唑西林、双氯西林为32μg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用面成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T6379.12004 ISO 5725-1;1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT)
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987，MOD)
3原理
用乙睛-水溶液提取试样中的分析物，固相萃取柱净化，高效液相色谱-串联质谱测定，外标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1乙睛：液相色谱纯. 4.2乙酸：液相色谱纯.4.3磷酸氢二钠.4.4氢氧化钠.4.55mol/L氢氧化钠溶液：100g氢氧化钠（4.4）溶解于450mL水中，加水定容至500mL.4.60.1mol/L磷酸盐缓冲溶液：6g磷酸氢二钠（4.3）溶解于450mL水中，用氢氧化钠溶液（4.5）调 节pH=8，加水至500mL.使用前配制.4.7乙睛-水溶液（31）:300mL乙晴（4.1)与100mL水混合.
4.8乙晴-水溶液（11）:100mL乙晴（4.1）与100mL水混合.4.9阿莫西林（CAS：26787-78-0）、氨苄西林（CAS:69-53-4）账拉西林（CAS：61477-96-1）、青霉素G夫西林（CAS：7177-50-6）和双氯西林（CAS：3116-76-5）九种青霉素标准物质，纯度均大于等于98%. （CAS：69-57-8)、青霉素V（CAS：132-98-9)、苯唑西林（CAS：7240-38-2）、氯唑西林（CAS：642-78-4）、奈4.10标准储备液：分别适量称取标准品（精确至0.0001g），用乙睛-水溶液（4.8）配制成100μg/mL的标准储备液.4.11混合标准中间工作液：取标准储备液（4.10）各1mL至100mL容量瓶中，用乙睛-水溶液（4.8）定容至刻度，配制成混合标准工作液，浓度为1uμg/mL. 4.12标准工作液：根据需要，吸取一定量的混合标准中间工作液（4.11），用空白样品提取液稀释至所需浓度，现用现配.4.13HLB固相萃取柱或相当者：500mg.6mL.使用前依次用3mL甲醇、3mL水和3mL磷酸盐缓4. 14滤膜：0. 2 yμm. 冲溶液（4.6）活化.
5仪器和设备
5.1高效液相色谱-中联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）.5.2分析天平：感量为0.01g. 5.3离心机.5.4旋涡混合器.5.5旋转蒸发仪.5.7 pH计. 5.6固相萃取装置.
6试样的制备与保存
取均匀样品约250g装人洁净容器作为试样，密封置4C下保存，并标明标记.
6.2奶粉
取均匀样品约250g装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记.
7测定步骤
7.1提取
牛奶样品称取约4g（准确至0.01g）于50mL具塞离心管中，奶粉样品称取约0.5g（准确至0.01g）并加入4mL水于50mL具塞离心管中.混匀.加入20mL乙晴-水溶液（4.7）高速振荡提取2min后，3000r/min离心10min，移取上清液过滤至鸡心瓶中.再用10mL乙睛-水溶液（4.7）重复提取一次，合并上清液于同一鸡心瓶中.
7.2净化
将提取液于45C下旋转蒸发至约7mL左右，加入2mL磷酸盐缓冲液（4.6），混匀后，转移到已活化的HLB固相萃取柱上，再用2mL磷酸盐缓冲液（4.6）洗涤鸡心瓶两次，洗液一并转移到柱上，控制流速小于2mL/min.用3mL水淋洗并抽干萃取柱，用4mL乙睛-水溶液（4.8）洗脱并收集于10mL带刻度的玻璃管中（控制流速小于2mL/min）.用水定容至4.0mL.涡旋混合后，过0.22gm滤膜供HPLC-MS-MS分析
7.3空白基质溶液的制备
将取牛奶阴性样品4g，奶粉阴性样品0.5g（精确到0.01g），按7.1和7.2操作.
7.4测定条件
7.4.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
a）色谱柱：苯基柱，5μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；色谱柱温度：30C；进样量：15gld）流动相梯度及流速见表1.
表1液相色谱梯度洗脱条件
流速/(μL/min) 0.1%甲酸水溶液/% 甲醇/%0 00 200 08 206 00 200 20 808 00 8 01 200 200 20 08 80 2010 0 200 80 20
7.4.2质谱参考条件
质谱参考条件如下：
a）离子化模式：电喷雾正离子模式（ESI)；b) 质谱扫描方式：多反应监测（MRM）；c) 鞘气压力：208kPa； 辅助气压力：55kPa；e) 正离子模式电喷雾电压（IS）：4000V；f) 毛细管温度：320C：g) 源内诱导解离电压：10V；h) i 碰撞气：高纯氢气： Q1为0.4.Q3为0.7；j）碰撞气压力：0.2 Pa；k）其他质谱参数见表2.
表2被测物的参考保留时间、采集窗口、监测离子对和裂解能量
化合物名称 保留时间/min 采集窗口/min 监测高子对（m/=） 裂解能量/eV阿莫西林 2.17 0~3 5 366 08/113 86* 22uorxoue 366 08/348 87 10ampicillin 氨苄西林 5 26 3 5~5 8 350 08/159. 91* 350 08/105 94 20 13呢拉西林 518 07/142 92 34piperacillin 6 66 5 8~12 518. 07/159 94* 12青霉素G 335 08/159. 86* 12peniilin G 6 85 5 8~12 335 08/175. 91 14青霉素V 7 11 5 8~12 351 07/113 81 33peniceillin V 351. 07/159 92* 11
