中华人民共和国国家标准
GB/T 28067-2011
Detection of sugarcane yellow leaf virus using the real-time RT-PCR
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
本标准起草单位：福建农林大学甘蔗综合研究所、农业部甘蔗及制品质量监督检验测试中心、农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室.
本标准主要起草人：高三基、陈平华、陈如凯、郭晋隆、张华、许莉萍、王恒波、陈由强.
甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法
1范围
本标准规定了甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法所需的仪器与试剂、样品的采集与前处理、操作方法以及结果判定.
本标准适用于甘蔗植株、种苗及种茎中甘蔗黄叶病毒的快速检测、诊断.
2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
2. 1反转录reverse transcription以RNA为模板合成DNA的过程，也称逆转录.
2. 2实时荧光RT-PCRreal timeRT-PCR实时荧光反转录-聚合酶链式反应.
2. 3Ct值cycle time 每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数.
3缩略语
下列缩略语适用于本文件.RNA.核糖核酸Tag 酶：Taq DNA 聚合酶dNTPs:4种脱氧核苷5'-三磷酸混合液M-MLV;莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney marine lenkemin virux）反转录酶 RNase: RNA MFAM6-骏基荧光素TAMRA：6-基四甲基罗丹明
4方法原理
在反转录酶作用下将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板利用Taq酶进行实时荧光PCR扩增反应（采用TaqMan探针方法）.在比对甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因的基础上，设计一对仅在甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针.探针的5*端标记FAM荧 光素为报告荧光基团，3'端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团，结合部位位于目的扩增片段内部.当完整的探针与目的序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3'端的率灭剂接近而被淬灭，仅器检测不到荧光信号；但在进行延伸反应时，Taq酶发挥5’→3的外切核酸酶功能，将探针降解，使得荧光基团
GB/T 28067-2011
与溶灭剂分离，所发出的荧光不再为淳灭剂所吸收而被检测仪所接受.随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累.因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系.
5甘蔗黄叶病毒基本信息
5.1病毒粒体形态特征
甘蔗黄叶病毒粒体为二十面对称体，直径24nm~29nm，浮力密度1.30g/cm²，由蛋白质外壳及其包裹着的一条单链、正义的RNA（ssRNA）构成，病毒基因组大小约6kb.
5.2寄主范围
自然寄主为甘蔗属中的热带种（Saccharumofficinaram）、大茎野生种（Saccharamrobustum）、中国种（Saccharum sinensis）和物手密(Saccharum sponfanexm）.
实验寄主包括蔗茅属（Erianrhussp.）、小麦、燕麦、大麦、水稻、玉米和高梁等.
在寄主植株内的分布主要局限于组织韧皮部内.
5.3寄主症状
田间病症表现为甘蔗叶片中脉黄化，并向两侧扩展，中脉下表皮为鲜黄色，上表皮仍是正常的白色或绿白色，有的染病品种叶片中脉两侧出现红褐色.染病植株叶片从叶尖开始干枯坏死，并向下扩展，leaf disease），早期称为甘蔗黄叶综合症（sugarcane yellow leaf syndrome）. 严重感病植株叶片发黄、坏死.由甘蔗黄叶病毒引起的这种病害称为甘蔗黄叶病（Sugarcane yellow
5.4分布地区
甘蔗黄叶病1989年首次发生在美国夏威夷，随后陆续在美国的弗罗里达州、德克萨斯州、路易斯安那州以及巴西、澳大利亚、南非、中国、印度等30多个国家和地区出现并不断蔓延扩大.
5.5传播途径
由甘蔗蚜虫（Melana phis sacchari）甘蔗绵（Ceratoruacwna lanigera）玉米叶蚜（Rhopalosiphammaidis）和水稻根际蚜虫（Rhopafosiphamrafiabdominalis）传播，也可由感病的种茎传播但不能通过种子、机械摩擦方式传播.
6病毒的分类信息
叶病毒属（Polerorirus）中成员，英文名称为 sugarcane yellow leafvirus 缩写为 SCYLV. 国际病毒分类委员会（ICTV）第8次报告将甘蔗黄叶病毒列人黄症病毒科（Lateoviridae）马铃薯卷
7仅器与设备
7.1实时荧光PCR检测系统. 7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.7.3电子天平：感量0.01g.7.4高速台式冷冻离心机：离心力12000g以上.2
7. 5撤量加样 器;0 1 zL ~2. 5 pL 0 5 μL~10 pl 5 μL~ 20L 10 μL ~ 100 yL 10 μL ~ 200 μl100 μL ~1 000 μL 7.7恒温水浴锅. 7.6无RNA酶的离心管、PCR反应管、Tip头、实时荧光PCR反应管.7.8鼓风干燥箱.7.9冰箱：2C~4C，-20C，-80℃
8试剂与材料
8.1试剂
除另有规定外，所用试剂均为分析纯或生化试剂；试剂均用无RNA酶的容器分装.
8.1.1三氯甲烷.8.1.2异丙醇，8.1.375%乙醇8.1.4无RNase水及双蒸水.8.1.5裂解液：主要成分为异硫氰酸肌和苯酚，为RNA提取试剂. 8.1.65X反转录反应混合液：含5×反转录反应缓冲液、dNTPs、RNase抑制剂、M-MLV反转录酶，具体配制方法参见附录A.
3'引I物:5'-ACTTTCTTGGCGTTCCTCTTG-3'扩增片段大小为130 bp.
8.2材料
8.2.1阳性对照：用已知含甘蔗黄叶病毒的样品作阳性对照.8.2.2阴性对照：用已知不含甘蔗黄叶病毒的样品作阴性对照.
9样品的采集与前处理
9.1取样工具
2 h- 欧刀、剪刀、镊子等取样工具应经121℃±2C、1.1×10Pa高压灭菌15min或经160℃干烤
9.2采样方法
9.2.2叶片样品：取甘蔗植株或种苗最高可见肥厚带叶上一叶（一1叶）叶片，编号备用.
9.2.1采样过程中应避免样本交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套.
