中华人民共和国国家标准
GB/T28068-2011
Detection of Xanthomonas citri subsp.citri using the real-timefluorescent PCR
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.
本标准起草单位：重庆大学、农业部农业技术推广服务中心、中华人民共和国北京出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：王中康、殷幼平、王福祥、高文娜、夏玉先、李正国、曹月青.
柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法
1范围
本标准规定了柑桔溃疡病菌（Xanthomonascitri subsp.citri，Xcc)的实时荧光PCR检测的样品制备、检测技术、操作方法及结果判定标准.
本标准适用于柑桔植物材料中柑桔溃疡病菌的实时荧光PCR检测和病害鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB5040柑桔苗木产地检疫规程
GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
柑桔溃疡病citrus canker disease
由柑桔溃疡病菌引起的国内外柑桔检疫性细菌病害.症状特征表现为柑桔叶片、枝条和果实表面出现隆起的木栓化溃疡病斑，造成柑桔落叶落果、树势衰弱，严重影响柑桔产量与果品外观质量.
3.2
柑桔溃疡病菌Xamrhomonas citri subsp.citri
指引起亚洲型柑桔溃疡病的病原细菌，为黄单胞菌属的柑桔黄单胞柑桔亚种新组合（Schaad2006：Young 2008).
实时荧光PCRreal-time fluorescent PCR
实时荧光聚合酶链式反应，一种在体外扩增微量的特殊DNA片段的方法，在扩增过程中由于荧光物质的释放并被实时检测而能够快速、灵敏地检出模板DNA的存在.
3. 4
扩增引物primer
扩增. 人工合成的寡核苷酸序列，其序列与待扩增的目标DNA序列中的一段相同，用于引导DNA体外
3.5
扩增模板templet
DNA体外扩增中所用的待扩增的靶标序列.
3.6
Ct值cycle threshold value
实时荧光PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定阀值时所经历的循环数.
3. 7
柑桔溃疡病菌重组质粒
菌特异性DNA扩增序列构建重组质粒，将该重组质粒转导到大肠杆菌JM109菌株中繁殖培养后重 利用特异性引物扩增柑桔溃疡病菌（Xanthomonax citri subsp.citri）基因组模板，获得的柑桔溃疡新提取出获得的质粒DNA.用于作为柑桔溃疡病菌检测的阳性对照.
4柑桔溃疡病菌基本信息
拉丁学名：柑桔黄单胞菌柑桔亚种Xanthomonas citri subsp.cirri Gabriel et. al（1989）.
病害名称：柑桔涉疡病citrus cancer disease.
分类地位：假单胞菌科Pseudomonaceae、黄单胞菌属Xanrhomonas，柑桔黄单胞Xanthomonascitri [Gabriel et al (1989)].
主要分布于亚洲的中国，印度和东南亚，美洲的美国、巴西、乌拉圭、巴拉圭和阿根廷等国家和地区.葡萄柚、甜橙、柠檬、莱檬、柑桔和积等柑桔种和品种.带菌种苗、接穗及商品果实是远距离传播的主要途径：田间则主要由夹风雨和农事操作传播.
相桔溃疡病菌其他信息参见附录A.
桔黄单胞柑桔亚种（A菌系）和褐色黄单胞莱檬亚种（BC/D菌系）（检测引物、检测方法及结果判定参见 利用柑桔溃疡病菌亚种通用引物对XccF05/XccR05，以常规PCR方法可以检测出柑桔材料中柑附录B）.
5方法原理
本标准采用的实时荧光PCR检测包括了荧光染料法和荧光探针法两种检测方法.其原理是，利用合而发出荧光被检测器实时检测（荧光染料法），或在合成特异性引物的同时合成一条特异性的荧光双模板，引物和探针则与模板上的序列配对面特异性结合，当PCR扩增延伸到探针结合部位时，Tag 标记探针，探针5端和3端分别标记荧光素报告基团和溶灭基团，如果反应体系中存在待测目标DNADNA聚合酶将探针水解成单核苷酸，使标记在探针上的报告基团游离出来并发出荧光信号被检测器实时检测（荧光探针法）.由于初始模板量的不同，反应管内的荧光物质达到设定的可检测阔值时所经历的Ct值不同，因此Ci值可以用于判定检测样品的初始菌量.
6实验室设置
柑桔溃疡病菌PCR检测实验室主要参照GB/T19495.2设置与管理.检测实验室应至少分为三个相对独立的工作区域：样本制备区、反应试剂配制区和检测区：每个工作区域应有明确标记，避免不同 工作区域内的设备、物品混用.
7材料与试剂
7.1仪器与器材
7.1.1实时荧光PCR仪. 7.1.2高速台式离心机.7.1.3生物安全柜或超净工作台.2
7.1.4冰箱（冷藏室4℃和冷冻室-20℃）7.1.5涡旋混匀仪，7. 1.7微量可调移液器（0.5μL~10μL、10μL~100pL、100pl~1 000gL) 7.1.6紫外灭菌灯.7.1.8带滤芯Tip头.7.1.9PCR反应管（0.2mL八联管）.7.1.10微滤柱. 7.1.11高压灭菌锅.
7.2试剂
7.2.3三羟甲基氨基甲烷（Tris）. 7.2.2磷酸氢二钠（NaHPO7HO）.7.2.4乙二胺四乙酸（EDTA).7.2.5实时荧光PCR 混合试剂（Real-time PCR Master Mix）.
7.2.1磷酸二氢钠（NaHPO，HO）.
8采样及样品处理
8.1采样及样品处理工具
8.1.1样品袋：牛皮纸袋或信封（一次性使用）.8.1.2枝剪.8.1.3剪刀，镊子. 8.1.4塑料离心管（1.5mL 50mL).8.1.2~8.1.4的取（制）样工具应经121℃士2℃，15min高压蒸汽灭菌.田间取样每个样品采集后或实验室处理每个不同样品后，工具应用70%酒精棉球擦拭2次以上，以避免样品间相互污染.
8.2取样方法
8.2.1田间采集
田间实地取样参照GB5040.取带有柑桔疑似溃疡病病斑的柑桔叶片、嫩梢和果实样品（柑桔溃疡病症状特征参见附录A）.
8.2.2口岸检疫及调运检疫抽样
种苗抽取显现疑似症状植株或随机抽取植株（无症材料）10株，每株取叶片5片，共50片：接穗等材料则随机直接抽取10份材料；商品果采集带有疑似病斑的果实.
样品采集后立即装入样品袋.按规定编号密封后，做好相关记载，包括样品品种、目测症状、采样人、采集地、采集时间等.及时寄送检测实验室.
8.3样品存放
采集的植物材料若需短暂保存，应置于4℃条件下，可保存1周.检测后余下的植物材料应置于4℃条件下保存7d以备复测的需要.
8.4样品DNA制备操作
样品DNA制备在检测实验室样品制备区进行.所制备的DNA样本在4C条件下保存应不超过
