中华人民共和国国家标准
GB/T28082-2011
Detection and identification of Ophiostoma novo-ulmi Brasierand Ophiostoma ulmi(Buisman）Nannf.
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院.本标准主要起草人：吴品珊、严进、杜洪忠.
榆枯萎病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准适用于来自榆枯菱病菌有发生国家和地区的榆属（UmasL.）苗木、原木、木制品和木包装 本标准规定了榆枯菱病菌的分离培养、形态学鉴定的方法.中榆枯萎病菌的检疫鉴定.
2榆枯萎病菌基本信息
中文名：榆枯萎病菌.
学名：Ophiostoma nowo-ulmi Brasier;
Ophiostomα a/mi (Buisman) Nannf.
异名 ：Ceratocystis ulimni ( Buism ) Moresu
病害英文名：dutch elm disease，elm wilt disease.
属真菌界Fungi子囊菌门Asycota，子囊菌纳Asycetes，粪科菌亚纲Sordariomyeetidae，长咏壳目Ophiostomatales，长喙壳科Ophiostomataceae，长喙壳属Ophiostoma.
榆枯菱病菌其他信息参见附录A.
3方法原理
依据无性孢子和有性世代的形态特征和生物学特性，以及其对寄主造成的症状特征进行检测鉴定.
4仪器
4.1生物显微镜.4.2体视显微镜.4.3光照生物培养箱.4.4高压灭菌器.4.6电子天平. 4.5超净工作台.4.7摇床.
5试剂和培养基
5.1试剂
（KHPO），硫酸镁（MgSO7HO)，硫酸锌（ZnSO ），三氯化铁（FeCl），维生素B，维生素B，放线 琼脂粉，麦芽膏，Oxoid麦芽提取物，榆树枝条，葡萄糖，天门冬酰胺（L-asparagine），磷酸二氢钾菌酮，链霉素，青霉素.
注：放线菌酬为剧毒品，注意防护.
5.2培养基
5.2.1选择性培养基
0.2g放线菌酮溶于100mL水，取50mL加于1000mL麦芽膏（MA）培养基内，灭菌后冷至45℃，加人10mL含1%链霉素和1%青霉素的混合液.
5.2.2麦芽膏培养基MA
25g麦芽膏，17g琼脂粉，1000mL蒸馏水，灭菌.
5.2.3榆边材培养基ESA
取50g健康的榆树边材或枝条，去皮粉碎成直径0.5cm的小块，15g琼脂粉，500mL蒸馏水，灭菌，
5.2.4Tchernoff改良培养液
20 g葡萄糖、2g天门冬酰胺、1.5g磷酸二氢钾、1g硫酸镁、20mg硫酸锌、10mg三氯化铁、1mg维生素B 和1mg维生素B，1000ml蒸馏水，灭菌.
5.2.5Oxoid麦芽提取物培养基MEA
33gOxoid麦芽提取物.10g琼脂粉.1000mL蒸馏水，灭菌.
6标准菌株
Ophiostoma novo-u/miA交配型（A mating type)，雌性：B交配型（B mating type)，雄性.Ophiostoma umi A 交配型（A mating type)，雌性；B交配型(B mating type），雄性. 中国检验检疫科学院保存病菌的标准菌株.
7检测
检查苗木、原木或木材的表面纵向和横向切开树干或枝条检查.
榆枯菱病菌的2个种引起的外观症状是相同的.在树干或枝条的横切面上，可见靠近外面的年轮附近有深褐色斑点或条纹，有时斑点密集，可连成断续的深褐色圆环.去掉树皮，木质部上有深褐色纵向条纹，有时条纹不明显，可轻前一层本质，条纹便显现出来.切开枝权处，常可找到小盘的蛙食槽.
取有如下症状的样品做病菌分离：干枯呈深褐色的枝条，有小囊驻食槽痕迹的树皮，横断面上有深褐色斑点或断续的褐色圆环枝干，纵切面有褐色条纹枝干，货物上附着有小囊虫.
8签定
8.1分离培养
养；对有虫蛀槽的树皮，清除蛙槽内的虫粪和残屑，70%酒精消毒10s~30s，无菌水冲洗，灭菌滤纸吸干 对变色的本质部，去掉树皮，切取直径为5mm大小，于选择性培养基（见5.2.1）上，20℃黑暗培水分，切取边长为5mm～10mm的大小，于选择性培养基上，20℃黑暗培养：小囊虫解肢为5mm大小，70%酒精消毒10s~30s，无菌水冲洗，灭菌滤纸吸干水分，于选择性培养基上，20℃黑暗培养.一
旦有真菌菌落出现，立即分别转Ⅲ.
转Ⅲ到ESA培养基，20C培养，以期获得粘束梗霉Pesotumuimi：转接于Tchernoff改良培养液中，室温下110r/min振荡培养，以期获得酵母状分生孢子Blastomyces：转Ⅲ到MEA培养基，20C黑 暗培养，以做种的鉴定.
8.2子囊孢子培育
子囊孢子需在A、B型2种交配型同时存在的ESA培养基上形成.如确认在ESA培养基上长出褐色粘束梗霉，同时取Ophiostomamoxo-almi（任意亚种）和Ophiostomaumi标准菌株的A、B交配 型，分别与分离出的病菌，等距离三角形接种在ESA培养基上，各重复3Ⅲ，20℃黑暗培养7d，然后室温（20C~25C）漫射光下继续珞养14d
8.3种的鉴定
菌落形态、菌落生长速度和最佳生长温度，是区分榆枯萎病菌两个种的主要指标.
取在MEA培养基上培养的新鲜菌块（2mm大小)，转接在MEA培养基中央，共转6Ⅲ，3Ⅲ置于20C黑暗培养，3Ⅲ置于33C黑暗培养.
D，按（D一D）/5计算病菌5d的平均辐射状生长速度（mm/d），最后将培养Ⅲ置于室温，没射光继 续培养10d，以观察菌落特征.
33C黑暗培养2d后，取出培养Ⅲ测量菌落直径E，继续在33C黑暗培养8d，再次测量菌落直径E，按（E一E）/8计算待测菌8d的平均辐射状生长速度（mm/d).最后将培养Ⅲ置于室温，漫射光继续培养10d，以观察菌落特征.
必要时做亚种鉴定（参见附录B）.
9结果判定
9. 1 Ophiostoma novo-ulmi
9.1.1菌落特征
在MEA培养基上，经20C黑暗7d和室温漫射光10d培养后，菌落灰白至乳白色，花瓣状、轮纹明显.气生菌丝量中等，常结集成绳索状使菌落有条纹呈现.欧亚亚种O.nowo-nlmisubsp.nowo-ulmi的菌落条纹较少，边缘有不规则的叶状浅裂.
O.noro-αmi在 20℃C黑暗条件下生长较快.生长速度为（2.8mm/d~）3.1mm/d~4.8mm/d（~5. 7 mm/d) ，33 “C的生长速度为(0 mm/d~10. 1 mm/d~0 5 mm/d.
9.1.2病菌形态
菌丝：分隔直径1pm~6pm，气生菌丝常结集成绳索状菌丝体分生孢子丰富.
粘束梗霉Pesotum umi：易在ESA培养基上形成，束丝无性态（synnematalanamorph）单个或多个，褐色到黑色，纤细，1mm~2mm长：褐色假根状菌丝附着在培养基上，褐色有隔菌丝平行构成束状，顶部张开分枝成透明的菌丝，其上产生分生孢子.分生孢子全壁芽殖、单胞、透明、卵形到椭圆形、大小为（2μm~6m）×（1μm~3pm），聚集成乳白色粘性孢子滴（参见附录C）.
发簇孢Sporothrix：可在大多数培养基上形成.分生孢子梗多侧生，10μm~30μm（~50pm），分生孢子（4.5μm~14μm）×（2μm~3μm），全壁芽生，有0.5μm~1μm的细齿，单胞、透明，椭网形至长形，尖端通常较细、微弯，连有一个小囊领，菌丝体分生孢子常聚成粘性滴状，酵母状芽殖.
