体
Microbiological examination of milk and milk products Methods fordetection of cocci
目次
前言 II1范围2规范性引用文件，3术语和定义4球菌检测5质量控制.6注意事项.7结果解释与应用.附录A
前言
本标准依据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
本标准内容应符合强制性国家标准、行业标准及地方标准：如有抵触，应以强制性标准为准.
本标准由宁夏计量质量检验检测研究院提出.
本标准由宁夏质量技术协会归口.
本标准起草单位：宁夏计量质量检验检测研究院、蒙牛（银川）乳品有限公司、国智（宁夏）知识产权服务有限公司.
阳、米江、赵燕、姚博伟、魏建设、段斌、刘杨琼、魏金娥、周慧、石亚东、王俊. 本标准主要起草人：谭勋哲、银鑫叶、刘杰、张静、田菊梅、简敏捷、吕晓东、方向
牛奶和牛奶制品微生物检验的球菌检测方法
1范围
本标准规定了牛奶和牛奶制品中常见球菌（如葡萄球菌属、链球菌属等）的检测方法.
粉、奶酪等）中目标球菌的分离与鉴定. 本标准适用于生乳及乳制品（包括但不限于巴氏杀菌乳、灭菌乳、调制乳、发酵乳、奶
注：本方法为标准化的实验室检测程序.用户应根据产品适用的食品安全国家标准（GB29921）的具体要求，确定是否需要开展特定致病球菌（如金黄色葡萄球菌）的检测，并正确应用检测结果进行符合性 判定
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB4789.1-2016食品安全国家标准食品微生物学检验总则GB4789.11-2014食品安全国家标准食品微生物学检验β型溶血性链球菌检验GB29921-2021食品安全国家标准预包装食品中致病菌限量 GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3. 1
球菌coccus
一类呈球形或近似球形的细菌，根据其排列方式可分为单球菌、双球菌、链球菌、葡萄球菌等，部分球菌可导致乳制品腐败变质或引发食激性疾病.
4球菌检测
4.1检验原理
本标准采用集成化检测设计，基于选择性培养基对牛奶及乳制品中常见的葡萄球菌属和链球菌属进行同步分离与鉴定.该方法通过共享样品前处理流程、并行分离培养，以及系统整体检测周期.与分别检测相比，本方法可减少重复操作，节约实验室资源. 化的形态学、染色及生化鉴定步骤，在保证检测准确性的前提下，旨在提升检测效率，缩短
球菌检测基于选择性培养基分离、形态学观察、染色特性及生化反应的综合鉴定.
葡萄球菌：在Baird-Parker琼脂上形成黑色或灰色菌落，周围有浑浊带和透明圈，触酶试验阳性，血浆凝固酶阳性者可鉴定为金黄色葡萄球菌.
链球菌：在血琼脂平板上形成灰白色小菌落，依据溶血类型（α、β、y）初步分类，结合CAMP试验、七叶苷水解、马尿酸钠水解等生化反应进一步鉴定为无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌等.
4.2试剂与材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水.具体试剂
配制方法见附录A.
4.2.1培养基：Baird-Parker琼脂、血琼脂平板、胰蛋白陈大豆肉汤.4.2.2染色液：革兰氏染色液.4.2.3生化试剂：3%过氧化氢溶液、兔血浆、糖发酵管（甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、 蔗糖等糖发酵管）、七叶苷培养基、马尿酸钠培养基.4.2.4稀释液：0.85%无菌氯化钠溶液.4.2.5无菌采样工具：无菌采样勺、采样管、无菌乳样杯、无菌吸管、无菌镊子等，使用前应经高压蒸汽灭菌（121°C，15min~20min）处理.
4.3仪器设备
4.3.1恒温培养箱：温度范围25°℃~65°℃，精度±0.5℃.4.3.2生物安全柜：垂直层流型，气流流速0.3m/s~0.5m/s，定期进行气流和洁净度验证.4.3.3显微镜：配备10×、40×、100×等物镜，可清晰观察细菌形态，配备油镜用于革兰氏 染色观察.4.3.4高压蒸汽灭菌器：能够达到121°C，压力103.4kPa4.3.5电子天平：感量为0.1g或0.01g.4.3.6均质器：转速8000r/min~10000r/min，可定时.
4.4检验步骤
4.4.1通则
为最大化提升检测效率，推荐实验室在计划同时检测葡萄球菌和链球菌时，采用整合流程.即从同一份样品制备出共用的1:10样品匀液（见4.4.2），并据此进行后续系列稀释.此后的分离培养（4.4.3）可在同一批次内，使用同一稀释度的样品匀液连续或同步完成两种培养基的接种，从而实现单次样品处理，完成多目标筛查.
4.4.2采样与样品处理
a）液态样品（生乳、巴氏杀菌乳等）：无菌操作吸取25mL（g）样品，加入225mL无 样品采样按GB4789.18的规定执行.实验室样品处理按以下步骤进行：菌氯化钠稀释液中，充分振摇，制成1：10的样品匀液.b）固态或半固态样品（乳粉、干酪等）：无菌操作称取25g样品，加入225mL无菌氯化钠稀释液，用均质器均质1min~2min，制成1:10的样品匀液. c）根据样品污染预期，用无菌氯化钠稀释液对1：10样品匀液进行10倍系列稀释，以备接种.
4.4.3分离培养
4.4.3.1葡萄球菌分离：将适当稀释度的样品匀液分别吸取0.1mL，涂布于Baird-Parker琼脂平板上，用无菌涂布棒均匀涂布，每个稀释度设两个平行平板.将平板置于36℃±1°C的恒温培养箱中培养24h~48h，观察菌落形态.典型的葡萄球菌菌落在Baird-Parker琼脂平 板上为圆形、凸起、直径1mm~2mm，颜色为黑色或灰色，周围有浑浊带和透明圈.
4.4.3.2链球菌分离：将适当稀释度的样品匀液吸取0.1mL，接种于血琼脂平板上，用无菌涂布棒均匀涂布，每个稀释度涂布2个平板.将平板置于36℃±1℃的恒温培养箱中培养24h~48h，观察菌落形态和溶血现象.链球菌在血琼脂平板上形成灰白色、半透明、表面光滑的小菌落，根据溶血现象初步判断种类，如邮溶血可能为无乳链球菌，a溶血可能为停乳链球 菌或乳房链球菌.
4.4.4鉴定
