中华人民共和国国家标准
GB/T 36852-2018
Detection andidentification ofErwiniapyrifoliae
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、南京农业大学、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、浙江大学、中华人民共和国烟台出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：赵文军、田茜、胡白石、田艳丽、易建平、楼兵干、李红叶、葛泉卿.
亚洲梨火疫病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了亚洲梨火疫病菌的分离培养、免疫学及分子生物学等检测方法.
本标准适用于梨苗木、砧本、接穗和幼果传带的亚洲梨火疫病菌的检疫鉴定以及病害的田间调查与“触理
2亚洲梨火疫病菌基本信息
中文名：亚洲梨火疫病菌
学名 :Erwinia pyrijfoliae Kim et al.
英文名：Shoot blight of Asian pear
菌目（Enterobacteriales），肠杆菌科(Enterobacteriaceae），欧文氏菌属(Erwinia）. 分类地位：细菌界（Bacteria），变形菌门（Proteobacteria），7-变形菌纲（Gammaproteobacteria），肠杆
传播途径：染病的梨的繁殖材料（包括种苗、砧木和接糖）、昆虫、风、雨、以及被污染的包装材料和运输工具等许多自然因素和人为因素都可引起亚洲梨火疫病的传插.其中，染病的梨的繁殖材料是亚洲梨火疫病远距离传播的主要途径.
亚洲裂火疫病菌的其他信息参见附录A.
3方法原理
DNA序列进行分子生物学检测：根据亚洲梨火疫病菌的培养性状、生物学特性、寄主范围及危害症状等 根据亚洲梨火疫病菌与抗体之间的特异性反应进行免疫学检测；根据亚洲梨火疫病菌的特异性对病原菌进行分离培养及致病性测定.
4仪器设备和主要试剂
4.1仪器设备及用具
超净工作台、恒温培养箱、摇床、超低温冰箱、常规冰箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、小型离心机、高速冷冻离心机、显微镜、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、制冰机、电子天平、涡旋振荡器、微量进样器、烘箱等.
4.2主要试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯.分子生物学检测所需试剂见附录B和附录C.
5检疫鉴定方法
5.1症状检查
参照附录A中的症状描述检查植株有无亚洲梨火疫病的典型症状，主要检查嫩梢、花、幼果和枝干
等部位.观察嫩梢是否出现萎（拐杖状）、变黑枯死：花和幼果是否变黑枯死；叶脉是否从叶柄基部向上变黑：枝干是否有溃疡斑：以及病组织上是否有菌账.对出现典型症状或可疑症状的植株进行拍照记录，并采集表现症状的嫩稍、花、枝干，幼果等送实验室检测鉴定.对于无症的幼嫩枝条，应重点对其顶端和基部取样.
5.2样品的制备
5.2.1显症植株样品的制备
疑似样本采集后应尽快检测，若不能及时检测，样本应在4℃～8℃下保存，尽可能不要超过一周.采集样品以及在运输和处理过程中应注意避免交叉污染.
样品处理应采用对分离培养、免疫学和分子生物学检测都有效的通用程序.为了成功进行富集，要使用新制备的抗氧化剂浸渍缓冲液[聚乙烯毗略烷酮（PVP）-10，20g：甘露醇，10g：抗坏血酸，1.76g： 还原型谷胱甘肽，3g：磷酸盐缓冲液（PBS），10mM，1L;pH7.2：过滤除菌].样品也可以用无菌蒸馏水或 pH 7.2 的 PBS(NaC1 8 g;KCI 0.2 g;NaHPO; 12HO 2.9 g;KHPO 0.2 g;蒸馏水，1 L)处理，直接用于分离培养、免疫学或分子生物学检测.
应尽可能选择表现出最典型症状并带有菌浓的植物部位（花朵、嫩梢、幼枝、叶片或果实）.处理用的材料挑取病健交界部位，将植物组织切成大约0.1g～1.0g的小块，放入装有适量抗氧化剂浸渍缓冲样品悬浮液，用于后续分离培养、免疫学检测及分子生物学检测.
5.2.2无症植株样品的制备
无症状样品可单个处理（最好如此），或者最多10个一组.采集样品时和提取过程中应小心避免交叉污染.
在3月下旬到6月底，即梨树开花期开始到果实膨大中期，采集花器、幼果幼梢枝段，装人无菌袋或容器中.从疑似植株上剪下长度约为20cm的嫩梢，或花期时的花器.如果在冬天进行分析，要从每株叶片的叶柄基部，或茎段.称取0.1g~1.0g植物材料，浸渍在按照5.2.1描述抗氧化剂缓冲液中，制成 植物上采集5个~10个花蕾，在实验室内，从挑选的植株上剪下花期时的花器、花梗和嫩梢下部儿个样品悬浮液.
因为细菌菌群少，对无症状样品直接进行检测时通常对亚洲梨火疫病菌表现为阴性.因此，在检测无症状材料时，应在25℃左右对用抗氧化剂缓冲液制备的样品进行72h富集.
建议使用两种经过验证的液体培养基进行富集，一种为非选择性（金氏B培养基），另一种为半选择性（CCT培养基）.取制备的样品浸出液0.9mL分别加人两个各装有0.9mL液体富集培养基（无琼脂的金氏B和使用营养肉汤面非营养琼脂制备的CCT培养基）的10mL~15mL的无菌试管中（确保通风良好）.试管在25C下无震荡培养48h～72h.在处理冬天采集的植物样品时建议培养更长时间.取适量样品富集培养液用于后续分离培养、免疫学检测及分子生物学检测.
CCT培养基分两部分制备.第一部分含：蔗糖，100g；山梨糖醇，10g：硫酸四葵钠，1.2mL；结晶紫，2mL（0.1%乙醇溶剂）：营养琼脂，23g：蒸馏水，1L：pH7.0~7.2：115C高压灭菌10min.将灭过菌的培养基冷却至大约45C.第二部分含：硝酸铊2mL（质量浓度为10g/L）：放线菌酮，0.05g：过滤除菌.将第二部分加人1L无菌的第一部分培养基中.
金氏B培养基含：蛋白豚，20g：甘油.10mLKHPO，1.5g；MgSO，7HO，1.5g；琼脂，15g；蒸馏水，1 L：pH7.0~7.2:120C高压灭菌20min
5.3免疫学检测
采用商品化ELISA方法进行检测，按照说明书进行操作及结果判定，若检测结果为阴性，直接判
GB/T 36852-2018
定为未检出亚洲梨火疫病菌.若检测结果为阳性，需进行分离培养鉴定及致病性测定.亦可不进行免疫学检测，直接进行分子生物学检测.
5.4分子生物学检测
5.4.1模板制备
对于植株样品，按照步骤5.2的方法制备成样品悬浮液或样品富集培养液后，直接用商业化植物基因组DNA提取试剂盒按照操作说明提取样品总DNA，一20C保存备用.
对于分离培养得到的疑似菌株，可直接或经裂解处理后（97C沸水浴10min：12000r/min离心10min，取上清液，一20C保存）作为分子生物学检测反应模板.
5.4.2PCR凝胶电泳检测
以E.pyrifoliae标准菌株作阳性对照，用非E-pyrifoliae的植物细菌作阴性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照，对待测样品进行PCR凝胶电泳检测，同时可采用植物内对照（例如COX基因来排除因核酸提取失败、降解，或因存在PCR抑制剂而引起PCR假阴性的可能性.具体检测步骤见附录 B.
5.4.3实时荧光PCR检测
实时荧光PCR检测具体步骤见附录C，对照及植物内对照设置同5.4.2.
5.5分离培养鉴定
按照5.2的方法制备成样品悬浮液或样品富集培养液后，用灭菌接种环取悬浮液在溶菌肉汤（LB）培养基平板上划线分离，或者用无菌水对样品悬浮液进行10倍梯度稀释，各取100pL稀释液涂板分离，各重复3次.25C恒温培养24h~48h，挑取可疑单菌落进行纯化，转接2次~3次，随后进行致病性测定、Biolog鉴定、免疫学或分子生物学鉴定.
在LB培养基上，亚洲梨火疫病菌形成与梨火疫病菌相似的乳白色菌落，但梨火疫病菌在LB蔗糖培养基上产生果聚糖，菌落较大而凸起，光滑呈透镜状，而亚洲梨火疫病菌在LB蔗糖培养基上不产生果聚糖菌落较小略有凸起.常见的污染菌草生欧文氏菌Eruiniaherbicola在LB上形成黄色菌落，因此可以排除.
LB培养基配制方法：胰蛋白陈10g酵母浸膏5g氯化钠10g，琼脂15g.加双蒸水至1000mL调节pH至7.5.湿热灭菌（121C，15min）.
5.6Biolog鉴定
利用Biolog微生物自动鉴定系统对分离纯化的菌株进行鉴定，按照说明书进行操作及结果判定.
5.7致病性测定
5.7.1幼果接种试验
取梨幼果（直径大约3cm~5cm）洗净晾干，用灭菌刀片横切果实，置垫有灭菌滤纸的培养Ⅲ上（加少量无菌水）.用接种针蔺取在LB培养基上培养24h~36h的待鉴定菌落，针剩接种到幼果的果肉组 织，一个横切面接种3个点～4个点.接种后，26℃保湿培养，诱导发病和菌的形成.大约24h后，观察接种部位有无坏死和菌产生，实验以无菌水为对照.
5.7.2枝梢接种试验
剪取梨树当年生的幼嫩枝梢，插于盛有自来水的三角瓶中，用接种针取在LB培养基上培养24h~
