CCS B 16 ICS 65.020.20
中华人民共和国国家标准
GB/T43163-2023
首黄萎病菌溯源检测方法
Traceabilitydetection ofVerticillium albo-atrumReinkeetBerthold
2023-09-07发布2024-04-01实施 国家市场监督管理总局发布 国家标准化管理委员会
GB/T43163-2023
前言
起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。
本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。
本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院。
本文件主要起草人：高瑞芳、章桂明、王颖、黄河清、向才玉。
GB/T43163-2023
首荐黄萎病菌溯源检测方法
1范围
本文件描述了应用基因片段和生物信息学分析方法对首黄萎病菌进行溯源检测的方法。
本文件适用于首黄萎病菌相关寄主植物材料中携带的首黄萎病菌的溯源检测。
2规范性引用文件
本文件没有规范性引用文件。
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 邻接法neighbor-joining 基于最小演化准则的选代聚类方法。
4方法原理
首黄萎病菌，拉丁名Verticilliumalbo-atrumReinkeetBerthold，基本信息见附录A。
溯源是利 用对物种有进化和溯源价值的基因片段将核酸序列信息与来源地、寄主等来源信息进行相关性归类。
检测过程是应用生物信息学的分析手段筛选有效区分种内差异并且有效归类的基因片段或分子标 记，获得这些基因片段或分子标记的核酸序列，应用统计学手段完成核酸序列与来源地、寄主信息的主 成分分析，完成不同来源地、寄主个体的群体分子系统进化关系和群体结构分析，基于基因序列的相似 度和重复率等，构建网络进化图。
5仪器和试剂
5.1仪器与试验用具
电泳仪、凝胶成像系统、高压灭菌锅。
试验用具：解剖刀、离心管、镊子、移液器、冻存管、培养皿、酒精灯、接种针。
5.2试剂 试剂：70%酒精、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)、PCRTaq酶、PCRTaq缓冲液、dNTP、DNA标 记、无菌超纯水。
1000mL，分装至三角瓶中，121°C高压蒸汽灭菌20min。
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6溯源检测方法 6.1DNA提取与纯化 对真菌进行液体培养或平板培养，按附录B中CTAB法对基因组DNA进行提取，溶解于无菌超纯 水中，测定DNA浓度及纯度后，保存于一20C冰箱备用。
6.2基因片段或分子标记的扩增与测序 内部转录间隔区（ITS片段）作为溯源分析的基因片段进行PCR扩增（具体步骤见附录C)，测序。
测序结果利用通用序列编辑软件进行剪接编辑，比对峰图和正反向测序结果是否有误，去掉两端引物部 分序列。
6.3分子系统进化分析 将拼接的库列导人通用分子系统进化分析软件，同时导人首黄菱病菌溯源序列排列文件mas格 式或meg格武，对金部序列进行排列，排列结果见附录D。
对排列后的mas格式文件，基于邻接法构建分子系统进化树（见附录E）选择Bootstrap检验 1000次重复，其他参数选择默认参数。
7结果判定 根据待分析序列在系统进化树上与已溯源首黄菱病菌的分支聚集结果进行判定。
如果字列与已溯源菌序列聚为一支且自展值为100邮可判定该物种序列与已知溯源信 息序列具有相同的来源地、寄主信息。
如果序列与已溯源菌株序列末与任物种痒列聚发支：需结合网络进化图做出判定。
在构 建的网络进化图中寻我待分析序列的进化分支起源点和方向，确认突变衍化历史。
如同一分支起源点的其他方向分支信息具有相关性，则可判定待分析个体与同一起源点不同 个体前来源地和寄主信息具有相关性。
如果同一分支起源点无其他方向分支，则无法判定待分析个体的来源地和寄主信息。
8样品与原始数据集保存 8.1样品保存 分离得到的菌种转移至马铃薯葡萄糖斜面培养基，置于4C黑暗条件下保存至少6个月，以备复 验、谈判和仲裁。
8.2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员 和审核人员签字。
PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件。
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附录A (资料性） 首蓉黄萎病菌相关信息
A.1基本信息 学名：Verticilliumalbo-atrumReinke&Berthold 分类地位：Fungi，Plectosphaerellaceae，Glomerellales，Hypocreomycetidae，S...
