中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4864-2017
转基因玉米检测 微流体芯片检测方法
Transgenic maize detection-Taqman array cardmethod
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.
ScientificCorp、中华人民共和国天津出人境检验检疫局. 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、LifeTechnologiesBrand、Thermofisher
本标准主要起草人：徐君怡、曹际娟、YaleiWu、郑秋月、徐杨、那晗、JennyXiao、贺艳、王建新、黄志、陈大军.
转基因玉米检测微流体芯片检测方法
1范围
本标准规定了食品中转基因玉米TC1507、NK603、MON87640、MON863、MON810、MIR162、GA21、DAS40278、BT176、BT11、98140、59122、3272、MON89034、MIR604、MON88017、T25等17个品系的微流体芯片检测方法.
本标准适用于玉米及其加工产品中转基因玉米TC1507、NK603、MON87640MON863、MON810、MIR162.GA21、DAS40278BT176、BT11 98140、59122、3272 MON89034.MIR604、MON88017、T25等17个品系的定性筛查检测.
本方法的定性检测低限为1%（质量分数）.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试脸方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3转基因产品检测 核酸提取纯化方法GB/T19495.7转基因产品检测 抽样和制样方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
3.1
转基因transgene
将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DXA序列，通过各种导人手段，使其在该物种中进行表达，以便该物种获得新的品种特征.
3.2
内源基因endogenous gene
基因的定量分析. 在栽培的物种中拷员数恒定的、不显示等位基因变化的基因，该基因可用于对基因组中某一目的
3.3
外源基因exogenousgene
利用生物工程技术转人的其他生物基因，使该生物品种表现新的生物学性状.
4方法原理
TaqMan技术是一种应用于核酸实时PCR检测的专利技术.该技术使用根据靶标核酸设计合成的DNA单链，并在单链的两端分别联上荧光报告基团和荧光淬灭基团，此结构称为TaqMan探针.
在PCR扩增的过程中，TaqDNA聚合酶会切断特异性结合在靶标DNA链上的TaqMan探针，使得探针的荧光报告基团发出特定波长的荧光，实现DNA分子的扩增与反应体系发出的荧光增长具有高度的一致性同步，通过荧光检测仪器，即可在PCR扩增的过程中，实时地检测或者定量反应体系中的DNA分子数目.
TaqMan微流体芯片将TaqMan探针包埋于微流体芯片检测卡中，使用TaqMan技术进行检测.
5仪器设备和主要试剂
5.1仪器设备
高速冷冻离心机：水浴培养箱：天平：感量0.001g：TagMan微流体芯片兼容PCR仅（适用的机型包括7900fastHT、ViA7、QuantStudioQ7、QuantStudio12K）：带有离心适配器的高速离心机：超净 工作台：制冰机：核酸蛋白分析仪：低温冰箱：纯水器或双蒸水器：旋满振荡器：微量进样器（0.5pL、2 μl.、100 μL).
5.2主要试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂.
醇：70%乙醇：CTAB裂解液：3%CTAB（质量与体积的比值）.1.4mol/LNaC1，0.2%（体积分数）硫基乙 实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格：TaqMan微流体芯片检测卡：氯仿：异戊醇：异丙醇.20 mmol/L EDTA 100 mmol/L Tris-HCI pH8.0; TE 级 液:10 mmol/L Tris-HCI pH 8.0;1 mmol/L EDTA pH8.0.
6检验方法
6.1防污染措施
TaqMan微流体芯片检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定，
6.2抽样制样
按照GB/T19495.7的规定执行.
6.3核酸提取纯化
荡保温1h：2000r/min离心5min；取上清液，加等体积氯仿/异皮醇（体积比：24/1）混匀，静置5min， 称取1g粉样于10mL离心管中，加人5mLCTAB裂解液（含适量RNA酶），混匀，60C水溶振8000r/min离心5min：小心取离心上清液，再加等体积氯仿/异戊醇（体积比：24/1）混匀，静置5min，8000r/min离心5min；取离心上清液加0.65倍体积的异丙醇，混匀，12000r/min4C离心10min：弃上清液，加500μL70%冰乙醇洗涤一次，12000r/min4C离心5min；弃上清液，将沉淀晾干，加人50μLTE，溶解沉淀（4C过夜，或37C保温1h）：此即为总DNA提取液，
也可用相应市售DNA提取试剂盒提取DNA，或按照GB/T19495.3执行.
6.4TaqMan微流体芯片检测方法
6.4.1阴性对照、阳性对照和空白对照的设置
检测过程中应按照GB/T19495.2中的规定设置对照.阴性目标DNA对照：不含外源目标核酸序列的DNA片段.
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品（或生物）中提取的DNA. 阳性目标DNA对照：参照DNA，或从可溯源的标准物质提取的DNA，或从含有已知序列阳性样
扩增试剂对照：该对照包括除了测试样品DNA模板以外的反应试剂，在TaqMan微流体芯片反应体系中用相同体积的水（不含核酸）取代模板DNA.
6.4.2TagMan微流体芯片反应体系
TagMan微流体芯片反应体系见表1，转基因玉米品系筛查检测所需的引物、探针信息见附录A.
表1TaqMan微流体芯片反应体系
试剂名称 pL/反痘2 × TaqMan Evironmental MasterMix 2.0 50DNA 模板(60 ng/μL~ 100 ng/μL) 5补水至 100注：表中DNA模板为原料的模板量，加工产品可视加工程度适当增加模板量：也可根据具体情况或不同的反应 总体积进行适当调整，
6.4.3TaqMan微流体芯片的工作流程
6.4.3.1上样
样孔即可，每张芯片，根据定制的格式不同，可以加人1个~8个样品的反应液. 将样品核酸和PCR预混液混合后，用移液器将100pL该溶液直接加人TaqMan微流体芯片的加
6.4.3.2离心进样
将TagMan微流体芯片效人专用的离心适配器中，在331g的吊桶式转头下离心两次，每次1min.通过此步骤，PCR反应液均匀地分配到384个PCR反应腔中.
6.4.3.3封口
TaqMan微流体芯片配备专用的封口器，可对进样后的芯片进行封闭处理：将芯片上各反应腔体的通路封闭，形成384个彼此独立的反应室.
束位置，随后将芯片取下，用剪刀将芯片突出的加样部分剪除即可完成对芯片的封口处理. 把待封口的芯片按照指定朝向放人封口器，手握封口器把手，平缓地把把手由起始位置推到封口结
6.4.3.4上机运行
TaqMan微流体芯片的运行需要配合兼容的PCR模块（Block）和热盖（HeatCover），适用的机型2min;95℃10min;95℃15s 60℃1min.40个循环. 为7900fastHT.ViiA7.QuantStudioQ7、QuantStudio12K.共4种.反应按照以下条件进行：50℃C
6.4.4结果分析
6.4.4.1基线的设置
TaqMan微流体芯片实时荧光PCR反应结束并分析结果后，应设置无效基线范围.无论采用任何荧光通道（FAM或VIC），基线范围选择在3个～15个循环，如果有强阳性样本，应根据实际情况调整
