准
淋洗类化妆品温和性评价 重建表皮模型组织活力法
Evaluation for mildness of rinse-off cosmetic productsTissue viability method of reconstructed epidermal model
浙江省健康产品化妆品行业协会 发布 出版
前言
本文件按照GB/T1.1-2020（标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由浙江省食品药品检验研究院提出.
本文件由浙江省健康产品化妆品行业协会（ZHCA）归口.
本文件起草单位：浙江省食品药品检验研究院、广东博溪生物科技有限公司、珀莱雅化妆品股份有限公司、上海家化联合股份有限公司、爱茉莉太平洋（上海）研发有限公司.
本文件主要起草人：何立成、桑晶、李乐、宋雅玲、袁登峰、余吴阳.
淋洗类化妆品温和性评价 重建表皮模型组织活力法
1范围
本文件描述了采用重建表皮模型对淋洗类化妆品温和性功效的评价方法.本文件适用于淋洗类化妆品温和性功效的评价.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于 本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
3.1
3.2
温和性mildness
经过安全评估的受试物在正常、合理及可预见的使用条件下，未引起皮肤异常反应的特性.
重建表皮模型reconstructedepidermalmodel
分离人组织表皮细胞作为种子细胞，经过体外培养，制备成与人表皮组织具有相似结构及功能的三维组织模型.
4试验原理
将经安全性评价为无刺激性的受试样品均匀涂抹在重建表皮模型上，经过比刺激性测试更长的暴露时间或更高暴露量后，根据模型细胞的存活率，评价受试样品的温和性.
5试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水.
5.2十二烷基硫酸钠（SDS）. 5.1聚乙二醇单-4-辛基苯基醚（TritonX-100）.
T/ZHCA 031-2024
5.3异丙醇.5.4噻唑蓝（MTT）.5.5磷酸盐缓冲液（DPBS）：pH7.0~7.3，不含钙、镁离子.5.61.0%TritonX-100溶液：吸取TritonX-100（5.1)10L溶于990L水中，配制成体积分数为1.0% 的 Triton X-100 溶液.5.8MTT溶液：称取噻唑蓝（5.4）20mg，溶于20.0mLDPBS（5.5）中，配制成质量浓度为1mg/mL的 5.70.1%SDS溶液：称取SDS（5.2)10 mg.溶于10mL水中，配制成质量分数为0.1%的 SDS溶液.MTT溶液，临用现配.5.9重建表皮模型试剂盒：EpiKutisRHE模型及其培养液，SkinEthicRHE模型及其培养液或其他经验证的等效模型及其培养液.接收时模型与培养基接触界面不应有明显气泡或固体培养基变色情况5.10死亡组织模型：将重建表皮模型置于-20℃环境下冷冻24h以上. （如黑紫色）.5.111.0%样品液：取受试物100gL溶于9900gL水中，配制成体积分数为1.0%的样品液.5.127.5%样品液：取受试物75pL，溶于925gL水中，配制成体积分数为7.5%的样品液.
5.13尼龙膜：与 SkinEthicRHE模型内径相同的尼龙膜.
6仪器设备
6.1天平：分度值为0.0001g.
围为（5士1)%、相对湿度≥95%.
6.3超净工作台或生物安全柜.
μL 200 pL
6.5连续分液器：25mL.
7测试方法
7.1MTT干扰因素排查
7.1.1当受试样品与MTT有反应时：取MTT溶液1.0mL，加入受试样品液80pL（方法一使用1.0%样品液，方法二使用7.5%样品液），分别在0h、1h、2h和3h时观察样品周边溶液颜色变化情况.当溶液颜色变成蓝紫色，应增加死亡组织模型组.
7.1.2当受试样品有颜色时：取受试样品液80uL（方法一使用1.0%样品液，方法二使用7.5%样品液），加人2mL异丙醇中，受试样品不溶于异丙醇，无须增加死亡组织模型对照组；受试样品溶于异丙醇，在570nm波长处测定吸光度（OD），若OD≥0.15，应增加死亡组织模型组.
7.2测试步骤：方法一（EpiKutisRHE）
7.2.1重建表皮模型复苏
化碳培养箱培养1h.更换全部培养液，放人二氧化碳培养箱培养过夜，模型底部与培养液间不应出 在超净工作台或生物安全柜中将合格的模型转移至含0.9mL培养液的无菌6孔培养板，放人二氧2
