NY
中华人民共和国农业行业标准
牛乳及其制品中免疫球蛋白lgG的测定 高效液相色谱法
Determination of immunoglobulin G in milk and dairy productsHigh performance liquid chromatography
中华人民共和国农业农村部 发布
前言
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由农业农村部畜牧兽医局提出.
本文件由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口.
本文件起草单位:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室(北京)、农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心(北京)、新疆农业科学院农业质量标准与检测技术限公司、黑龙江飞鹤乳业有限公司. 研究所、中优乳奶业研究院(天津)有限公司、唐山市食品药品综合检验检测中心、内蒙古智慧质量中心有
本文件主要起草人:刘慧敏、叶巧燕、赵艳坤、郑楠、陈岭军、张宁、屈雪寅、郭洪侠、张慧萍、王象欣.
牛乳及其制品中免疫球蛋白IgG的测定高效液相色谱法
1范围
本文件描述了牛乳及其制品中免疫球蛋白IgG测定的高效液相色谱方法.
本文件适用于生牛乳、巴氏杀菌牛乳和添加了含有免疫球蛋白IgG成分的牛乳基婴幼儿配方乳粉中免疫球蛋白IgG含量的测定.
本文件中生牛乳、巴氏杀菌牛乳中免疫球蛋白IgG的定量限为10mg/kg;添加了含有免疫球蛋白IgG成分的牛乳基娄幼儿配方乳粉中免疫球蛋白IgG的定量限为40mg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款,其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括的修改单)适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义.
4原理
定,外标法定量. 试样中的免疫球蛋白IgG用磷酸缓冲溶液提取,经ProteinG亲和柱富集净化,用高效液相色谱仪测
5试剂或材料
除非另有规定,仅使用分析纯试剂.
5.1水:GB/T6682,一级. 5.2三氟乙酸:色谱纯,5.3乙晴:色谱纯.5.4氢氧化钠溶液(10mol/L):称取40g氢氧化钠用80mL水溶解,定容至100mL,混匀.5.5盐酸溶液(10mol/L):量取250mL盐酸(含量36%~38%),缓慢倒人50mL水中,混匀.5.6三氟乙酸溶液(0.1%):准确移取1mL三氟乙酸(5.2),用水定容至1L,混匀.临用现配.5.7三氟乙酸乙睛溶液(0.1%):准确移取1mL三氟乙酸(5.2),用乙晴(5.3)定容至1L,混匀.临用现配.5.8磷酸盐缓冲溶液:称取无水磷酸二氢钾6.8g,加950mL水溶解,混匀.用氢氧化钠溶液(5.4)调节 pH至7.00土0 05,用水定容至1L,混匀.临用现配.5.9甘氨酸洗脱溶液(0.1mol/L):称取甘氨酸(优级纯)1.5g.加190mL水溶解,混匀.用盐酸溶液(5.5)调节pH至2.50土0.05,用水定容至200mL,混匀.临用现配.5.10免疫球蛋白lgG标准储备溶液:8.5mg/ml”,按照附录A校准;或市售有证标准物质.5.11免疫球蛋白IgG标准中间溶液(1mg/mL):准确移取适量牛免疫球蛋白IgG标准储备溶液
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(5.10),用甘氨酸洗脱溶液(5.9)稀释并定容,使其浓度为1mg/mL.临用现配.5.12免疫球蛋白IgG标准系列溶液:准确移取一定量的免疫球蛋白IgG标准中间溶液(5.11).用甘氨酸洗脱溶液(5.9)稀释定容,配制成牛免疫球蛋白IgG浓度分别为5mg/L、10mg/L、40mg/L、80mg/L、5.13ProteinG 亲和柱;2 mg protein G/mL,1 mL”;或其他性能类似的纯化柱. 160mg/L和200mg/L的标准系列溶液.临用现配.5.14微孔滤膜:水系,0.22μm.5.15玻璃纤维滤纸:0.45pm
6仪器设备
6.2紫外-可见分光光度计:波长精度士2nm. 6.1液相色谱仪:配紫外检测器或二极管阵列检测器.6.3天平:精度为0.01g、0.1mg和0.01 mg.6.4涡旋混合器.6.5离心机:转速不低于12000r/min.6.6固相萃取装置.6.7pH计:精度为士0.01.
7样品
7.1生牛乳、巴氏杀菌牛乳
取有代表性样品约200g,混匀,装人洁净容器中,立即测定.
取有代表性样品约200g,混匀,装入洁净容器中,常温密闭保存.
8试验步骤
8.1提取
平行做两份试验.称取生牛乳或巴氏条菌牛乳试样10g(婴幼儿配方乳粉5g),精确至0.1mg,于50mL离心管中,加人30mL磷酸盐缓冲溶液(5.8).涡旋1min.全部转移至50mL容量瓶中,用磷酸盐 缓冲溶液(5.8)少量多次清洗离心管,溶液合并至容量瓶,并定容.溶液转移至50mL离心管中,12000r/min离心10min,过滤(5.15),滤液待净化.
8.2净化
用10mL磷酸盐缓冲溶液(5.8)活化亲和柱(5.13),准确移取20mL滤液(8.1)过柱,用10mL磷酸5mL,涡旋混匀,过膜(5.14),待测. 盐缓冲溶液(5.8)淋洗,4mL甘氨酸洗脱溶液(5.9)洗脱,收集洗脱液,用甘氨酸洗脱溶液(5.9)定容至
8.3液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下:
a)色谱柱:C色谱柱(300A).柱长250mm,内径4.6mm,粒径3.5μm,或性能相当者;b)检测波长:280nm;c)流速:1.5mL/min; d)柱温:65C;e)进样:30yuL;f)流动相:A为三氟乙酸溶液(5.6).B为三氟乙酸乙晴溶液(5.7).梯度洗脱条件见表1.