中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T4848.4-2017
出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR法 第4部分：按树
Identification of mon honey plant species in export honey-Real-time PCR method-Part 4;Eucalyptus
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4848（出口蜂蜜中常见密源植物成分的检测方法实时荧光PCR法》系列标准共分为8部分：
第1部分：荆条：第2部分：油菜；第3部分：洋槐： 第4部分：按树：第5部分：般树；第6部分：龙眼：第8部分：紫云英， 第7部分：荔枝和龙眼；
本部分为SN/T4848的第4部分
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国安徽出人境检验检疫局.
本部分主要起草人：李想、韩丽、薛华杰、李辉、任怡菲、吴亚君、宗凯、陈颖、郑怡、门光琦、杨艳歌、韩建勋.
出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法
实时荧光PCR法
第4部分：按树
1范围
SN/T4848的本部分规定了出口蜂蜜中楼树成分的实时荧光PCR 检测方法.
本部分适用于出口蜂蜜中楼树 成分（柠檬楼、蓝楼、巨楼、直干按、大叶楼、缘楼、赤楼）的定性检测.本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为0.5%（质量百分比）.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是业 不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T27403-2008实验室腾量控制规范 食品分子生物学检测
3术语和定义
3.1 下列术语和定义适用于本文件
蜂蜜honey
蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或密 .与自身分泌物混合后，经充分酿造面成的天然甜物质.3.2
楼树 eucalyptus
实时荧光PCRreal timePCR
在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始模板的定量及定性分析.
3.4
Ct值cycle threshold
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）
SN/T 4848.4-2017
dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleoside triphosphate）dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate）dCTP：脱氧胞三磷酸（deoxycytidine triphosphate）dGTP：脱氧乌花三磷酸（deoxyguanosine triphosphate）UNG：尿喀啶N-糖基化酶（uracil N-glycosylase） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate）CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris（Hydroxymethyl）aminomethane]EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene dinminetetraacetic acid)Taq：水生栖热菌（Thermus aquaticus） OD：光度密度（opticaldensity）FAM：基荧光素（Carboxyfluorescein）BHQ1：黑洞猝灭基团1（Blackhole quencherl）.
5方法提要
提取样品DNA，以按树来源DNA为阳性对照，以其他蜜源植物DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照，使用按树的特异性引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象判定是否存在楼树成分.
6试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂.实验用水符合GB/T6682的要求.试剂均用无DNA酶污染的容器分装，
6.1检测用引物和探针：按树成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见表1.楼树引物扩增的靶标序列参见附录A.
表1楼树基因扩增引物探针序列
物种名称 引物/探针序列（5→3） 扩增片 把基因段长度内参照 R;AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA F GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA 138 bp NADH dehydrogenaseP;FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1 subunit B( ndAB )geneF ATTGTAGCAACTGAAATCTTTCTTAR GTATTGATGCTTTATTACACTGCCT楼树 P1:FAM-ATGCAGATAAAGGGAAGGTTGAGAGAA-BHQ1 187 bp ribosmal protein L16P2:FAM-TGCAGATGGAGGGAAGGTTGAGAGAA-BHQ1
6.2 三氯甲烷（氯仿）6.3异丙醇.6.4体积分数为70%的乙醇.6.5NaCl溶液（1.2mol/L).
2
6.6蛋白酶K（20mg/mL).6.7 CTAB 提取缓冲液：20 g/L CTAB 1.4mol/L NaCl 0.1 mol/L Tris-HC1 0.02 mol/1 NaEDTA pH 8.0.6.8CTAB沉淀液：5g/LCTAB.40mmol/L.NaCl. 6.910×PCR 缓冲液:200 mmol/L Tris-HCI(pH 8.4) 200mmol/L KC1 15 mmol/L MgCl6.10实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U~2U（Unit，酶学单位）的Taq酶、1×PCR buffer、2.5 mmol/L~4.0 mmol/L 的 Mg²*0.2 U~1 U 的 UNG 酶、0.2 mmol/L 的 d(A.C.G)TPs、0.2mmol/L~0.4 mmol/L dUTP、400 nmol/LROX染料（某些荧光 PCR仅无需ROX 校正）.
7仪器设备
7.1实时荧光PCR仪.7.3恒温水浴锅. 7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.7.5微量移液器：0.5pL~10pL，10pL~100plL.20μL~200L，200pxL~1 000μL.7.6恒温混匀仪.7.8pH计.7.9量筒：容量50ml.7.10烘箱.
7.4离心机：离心力≥12000g
7.7涡旋震荡器.
8检测步骤
8.1DNA提取
8.1.1蜂蜜沉淀DNA提取
8.1.1.1蜂蜜样品50C水浴20min至充分融化，上下颠例混匀.8.1.1.2取20mL蜂蜜样品，分成2管，每管10mL于50mL离心管中，加人无菌双蒸水至30mL，涡旋混匀，4000：/min离心10min，吸出上清（4C贮存备用）.8.1.1.3沉淀部分用1mL无菌水洗脱，分装于2mL离心管中.12000r/min离心5min，去除上清. 8.1.1.4加入600pLCTAB提取缓冲液，置于65“C恒温混匀仪中温育1h~2h，转速为650r/min:12000r/min离心10min.8.1.1.5转移上层清液至2mL离心管中；加人0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温下12000r/min离心10min8.1.1.6加人等体积CTAB沉淀液混匀，13000r/min离心10min. 8.1.1.7弃上清，加人350gl.1.2mol/LNaCl溶液，充分溶解沉淀.8.1.1.8加人0.8倍体积的异丙醇混匀，-20C放置0.5h~1h.12000r/min转速4C离心10min~15 min.8.1.1.9弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次.12000r/min转速下4℃离心10min， 8.1.1.10弃上清，室温下晾干.加人50pL~100pL双蒸水，溶解沉淀，-20C保存
8.1.2蜂蜜上清DNA提取
将上清分装到2个50mL离心管中，每管20mL.参照附录B步骤进行核酸DNA提取，DNA存放
