中华人民共和国国家标准
GB/T 15670.22-2017
农药登记毒理学试验方法 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害 与修复/程序外DNA合成试验
Toxicological test methods for pesticides registrationPart 22 :DNA damage and repair/unscheduled DNA synthesis testinmammalian cells invitro
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则：第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法；第3部分：急性经口毒性试验序贯法： 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；第6部分：急性吸人毒性试验：一第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验： 第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验；一第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验； 第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验；第13部分：亚慢性毒性试验；第14部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验； 第18部分：嘀齿类动物显性致死试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验；一第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验； 一第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；第23部分：致畸试验：-第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验； 第27部分：致癌试验；第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第22部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本部分由中华人民共和国农业部提出并归口.本部分起草单位：农业部农药检定所.本部分主要起草人：张宏伟、张丽英、陶传江.
农药登记毒理学试验方法 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害 与修复/程序外DNA合成试验
1范围
GB/T15670的本部分规定了体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验的基本原则、方法和要求.
本部分适用于为农药登记而进行的体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验，
2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
2.1
程序外DNA合成unscheduled DNA synthesis;UDS
发生在细胞周期的S期半保留DNA程序合成之外的DNA合成.
2.2
净核银粒netnucleargrain：NNG
在放射自显影UDS试验中细胞内UDS活性的定量测定，计算为核银粒数（NG）减去等于核面积的细胞质内银粒平均数（CG），即NNG=NG一CG.由各细胞计算NNG数，再将一个培养物或平行培养物中的细胞NNG汇总.
3试验目的
该测试系统是通过对DNA修复合成水平的检测来评价受试物能否对原代哺乳动物细胞和已建立的哺乳动物细胞系的DNA造成损伤及损伤的程度.由于UDS反映损伤的切除修复过程，并反映出损伤的程度，因此可作为化学致癌剂短期生物学试验的判断终点.
4试验概述
将分离和培养的非S期哺乳动物细胞移入含胸腺嘧啶核昔（H-TdR）和受试物的培养瓶中，孵育一定时间后，观察H-TdR掺人情况，如某受试物造成了细胞DNA损伤，必然引起细胞的自主性DNA 修复，在修复过程中H-TdR整合人DNA链中，造成H-TdR在修复后DNA中的掺入.再用放射性自
除非采用肝原代细胞作为靶细胞，培养的哺乳动物细胞均要在加和不加外源性代谢活化系统两种情况下与受试物作用.
鉴于原代培养肝细胞存在易于分离培养、保留肝微粒体酶系等优点，建议用原代培养肝细胞作为试验的靶细胞.
5试剂与器材
5.1试剂
注：全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为双蒸水.
5.1.1细胞增殖用培养基
Eagle氏最低必需培养基（minimalessentialmedium，Eagle）85份，小牛血清15份，加人青霉素、链霉素贮存液1份，使青霉素、链霉素的最终浓度分别为100单位及100Pg/mL.EMEM培养基可选用各种商品供应的粉末培养基按生产厂商提供资料配制并除菌，4C冰箱贮存.
5.1.2同步用培养基
不含精氨酸的Eagle氏最低必需培养基（minimalessentialmedium，Eagle）98份，小牛血清2份，青霉素、链霉素浓度同细胞增殖用培养基.
5.1.3Hanks平衡盐溶液（HBSS)
贮液A：将氯化钠160g、氯化钾8g、硫酸镁（MgSO7HO）2g及氯化镁（MgCl6HO）2g溶于800mL双蒸水（50C~60C）中.另取无水氯化钙2.8g溶于100mL双蒸水中.将上述两溶液混合后，加水至1000mL，加人三氯甲烷2mL，保存于4C中.
KH;PO；2H;O)1.2g（或KH：PO0.95g）、葡萄糖20g溶解于800mL双蒸水中，加人100mL 贮液B:将磷酸氢二钠（NaHPO12HO）3.04g（或NaHPO2HO1.2g）、磷酸二氢钾0.4%酚红溶液（取酚红1g，溶于3mL1mol/L氢氧化钠中，待完全溶解后，加人双蒸水中至250mL），加水至1000mL，加人三氯甲烷2mL，保存于4℃中.
贮液C：1.4%碳酸氢钠，以双蒸水配制.
应用液的配制：取A液1份，B液1份，水18份，混合后分装于玻聘容器内，高压灭菌，4C保存.用前加人1.4%碳酸氢钠，将pH调整至7.2~7.4.
5.1.4磷酸缓冲液（无钙、镁的Dulbecco氏磷酸缓冲盐液）（pH7.4）
1000mL双蒸水中. 取氯化钠8.00g、磷酸二氢钾0.20g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠（Na:HPO；12H;O）2.89g溶于
5.1.50.02%乙二胺四乙酸二钠或四钠（EDTA）溶液
取EDTA0.2g溶于无钙、镁的磷酸缓冲液中，使成1000mL.高压灭菌后使用.
5.1.6抗菌素贮存液
取临床注射用青霉素G100万单位及链霉素1g粉针，在无菌操作下溶于100mL灭菌蒸馏水中，使青霉素及链霉素在溶液中的浓度分别为1万单位及10000pμg/mL，使用时每100mL培养基中加人抗菌素贮存液1ml.
5.1.7大鼠肝微粒体S9混合液（10%）
每10mL由以下成分组成，临用时配制：
磷酸盐缓冲液（0.2mol/L，pH7.4) 6.0 mL氯化钾溶液（1.65mol/L) 0.2 mL
氯化镁溶液（0.4mol/L) 0.2 mL6-磷酸葡萄糖溶液（0.05mol/L) 1.0 mL辅酶II（CoI）溶液（0.25mol/L) 1.6 mL肝S9液 1.0 mL混匀，置冰浴中待用.
5.1.8显影液及定影液（放射自显影用）
5.1.8.1Kodak D-170显影液
贮液：无水亚硫酸钠25g、溴化钾1g，加水至200mL.使用时用水稀释至1000mL，溶入2-氨基酚盐酸盐（amitol)4.5g.
5.1.8.2KodakD-196显影液
水（50°℃）500mL，顺次溶人米吐尔（硫酸对甲氨基苯酚）2g、无水亚硫酸钠72g、对苯二酚8.8g、无水碳酸钠48g、溴化钾4g，加水至1000mL.
5.1.8.3停显液
98%冰乙酸15mL 加水至1000mL.
5.1.8.4Kodak F-5定影液
水（50℃）100mL，依次溶人硫代硫酸钠240g、无水亚硫酸钠15g.28%乙酸48mL、硼酸（结晶）7.5g、钾砚15g，加水至1 000mL.
5.1.90.25mol/L及0.5mol/L高氯酸
70%高氯酸（售品）8.57mL，加水至100mL为1mol/L，倍比稀释至所需浓度.
5.1.10闪烁液
2，5-二苯基曝唑（PPO）5g、1，4-双-[5-苯基曝唑基-2]-苯（POPOP）300mg溶于甲苯中，配成1 000 mL.
5.2器材
5.2.1玻璃类
在自来水中将污物冲净，在肥皂或洗衣粉溶液中煮沸5min，稍冷后在热肥皂水内反复洗刷，用自来水冲洗干净.干后浸于清洁液内过夜，取出后用自来水反复冲洗12次.再用蒸馏水冲洗2次，于蒸偏水中浸泡24h.取出后用蒸馏水再冲洗2次，烘干.所用玻瓶用纸包扎瓶口，移液管及滴管在近端管 内塞入棉花栓后用纸包裹.
5.2.2橡皮类
酸煮沸10min.自来水流水冲洗2h以上.再于蒸馏水中煮沸2次，用蒸馏水冲洗后，浸泡于蒸馏水中 自来水中冲洗干净后，在肥皂水内煮沸.若为新购置的，则用4%氢氧化钠煮沸10min，再用4%盐24h，干燥后，用玻璃纸包装，置于容器内.
5.2.36号玻璃滤器（除菌用）
新购置的滤器浸人含少量亚硝酸钠的热硫酸内24h，蒸馏水抽滤后，用氢氧化钠溶液抽滤至中性，
