T/ZJSC 2025-0023
Detection protocols for Trionyx sinensis flavivirus disease
浙江省水产学会 发布
前言
起草. 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由浙江省水产学会提出并归口.
本文件起草单位：浙江省淡水水产研究所、浙江省农业科学院.
本文件主要起草人：袁雪梅、张海琪、刘莉、姚嘉资、陈静、焦锦彪、吕孙建、郭琦.
中华鳖黄病毒病诊断方法
1范围
定了采样要求、RNA提取、RT-PCR检测、RT-qPCR检测和综合判定的方法.本文件适用于中华整黄病毒 本文件给出了中华鉴黄病毒病诊断方法的缩略语、试剂和材料、仪器和设备，描述了临床症状，规的流行病学调查、诊断、检疫和监测.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T7011.1水生动物疾病术语与命名规则第1部分：水生动物疾病术语 SC/T7011.2水生动物疾病术语与命名规则第2部分：水生动物疾病命名规则T/ZJSC0013-2025沼虾黄病毒检测方法
3术语和定义
SC/T7011.1和SC/T7011.2界定的术语和定义适用于本文件.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.BHQ1:漳灭剂（black hole quencher 1)bp:碱基对（base pair） Cr值：阅值循环数，即实时荧光定量PCR检测中荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数(cyclethreshold value)DEPC：焦碳酸二乙酯（diethy1Pyrocarbonate） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸混合物（deoxy-ribonucleoside triphosphatemixture）EDTA: 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid) FAM：羧基荧光素（carboxyfluorescein）M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus）PCR：聚合酶链式反应（polymerase chainreaction） RTPCR：逆转录PCR（reverse transcription PCR）RTqPCR： 实时荧光RT-PCR (reverse transcription quantitative realtime PCR)Taq DNA聚合酶：水生栖热菌DNA聚合酶（7heramus aquaticus DNA polymerase） TSFV：中华整黄病毒（Trionyx sinensis flavivirus）
5试剂和材料
本文件中化学试剂，除非另有规定，仅使用分析纯试剂：水为符合GB/T6682中规定的一级水.
5.1DEPC：4C保存.
5.45×M-MLV逆转录酶缓冲液：商品化试剂，-20C保存.
5.5M-MLV逆转录酶（200U/L）：商品化试剂，-20C保存.
5.6RNA酶抑制剂（40U/L）：商品化试剂，-20C保存.
5.7随机引物Random primers（500 ng/L）：商品化试剂，-20C保存.
5.810XPCR缓冲液（无Mg）：商品化试剂，-20C保存.
5.975%乙醇：按A.1配制.
5.10 EDTA (0.5 mo1/L，pH 8.0)：按A.2 配制.
5.1150XTAE电泳缓冲液：按A.3配制.
5.121XTAE电泳缓冲液：按A.4配制.
5.13MgC12（25mmol/L）：商品化试剂，-20“C保存.
5.14TagDNA聚合酶（5 U/μuL)：商品化试剂，-20C保存.
5.15琼脂糖：电泳级.
5.16核酸染料：商品化试剂，4C保存.
5.17DNAMaker：商品化试剂，-20C保存.
a)TSFV598F: 5′CCTCAGAGACAGTGAAGAGGTGATAA3′:b)TSFV598-R:5′GCCATGTTCATTGGCTACAAC-C3′:
5.19TSFV荧光定量PCR引物：引物浓度为10Hmo1/L，-20C保存.扩增引物分别是TSFY-Tq106F和TSFV-Tq106R，扩增TSFV多聚蛋白基因中的106bp片段，探针TSFV-TqMAN（见附录B.2）.引物、探针 序列如下：
a)TSFVTq106F:5′AGGAACCAGAGCGTACAGAGAA3′;b)TSFV-Tq106R:5′CACCACAAACACTCCCAATGT3′; c) TSFVTaqMAN: 5′6FAMACTGCTGCAAGTGCTATTGTCACTCCTBHQ13′
5.20阳性对照为确定感染TSFV的中华整组织样品，-80C保存.
5.21阴性对照为确定未感染TSFV的中华鉴组织样品，-80C保存.
5.22空白对照为DEPC水.
6仪器设备
6.1PCR仪.6.2荧光定量PCR仪：具有FAM荧光检测通道.6.3水平电泳仪.6.4紫外观察仪或凝胶成像仪：波长范围280nm～320mm.6.5低温高速冷冻离心机：4C，转速>12000r/min.6.6水浴锅或金属浴.
6.7普通冰箱.6.8-80C超低温冰箱.6.9微波炉.6.10微量移液器.
7临床症状
患病鉴腹部肿胀，部分出现底板发红、咳血、腹水充盈的症状.参见附录C.
8样品采集
8.1采样对象
稚鳖、幼鉴或成鳖.
8.2采样数量
具有临床症状的整采3只～5只：无临床症状的整采8只～10只.整样品运送至实验室，活体及时取样.
8.3采样部位
采集肝脏、脾脏、肾脏和肺等组织.对于只能用非致死性方式取样的亲鳖，可采集血液.
9RNA提取
按T/ZJSC0013-2025的规定执行.
10RT-PCR检测
10.1cDNA合成
按T/ZJSC0013-2025的规定执行.也可采用等效的商品化cDNA合成试剂盒，或在10.2中采用等效的商品化一步法RT-PCR试剂盒，省略cDNA合成步骤.
10.2PCR扩增
临用前，加入相应体积的TagDNA聚合酶，混匀，按24uL/反应分装到PCR管中，然后分别加入1ul10.1 按照表1的要求，加入除TaqDNA聚合酶以外的各项试剂，在冰盒上配制成预混物，保存于-20℃.步骤合成的cDNA.置于PCR仪中，按以下程序进行PCR扩增：95C5min：94C30s、58C30s、68C20s，30个循环：68C5min，最后4C保存.也可采用等效的商品化PCR试剂盒或一步法RT-PCR试剂盒.
表1单个PCR反应预混物配制
试剂 体积/u 试剂终浓度10×PCR缓冲液（无Mg²） 2.50 1XPCR缓冲液MgC1 (25 mmo1/L) 2.00 2. 00 mmo1/LdNTPs (各 2. 5 mmo1/L) TSFV598F 和I TSFV598R (10 μeo1/L) 各0.50 2. 00 0. 20 μmo1/L 200 μmo1/L灭菌双蒸水 16.0Taq DNA 聚合酶(5 U/μL) 0.50 0. 1 U/L
