中华人民共和国国家标准
GB/T31804-2015
Detection and identification of Apple scar skin viroid
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口，
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中国农业科学院植物保护研究所、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、青岛市农业科学研究院、中华人民共和国山东出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：张永江、廖力、廖富荣、辛言言、邓丛良、李世访、马荣群、李明福、李桂芬、魏梅生、张成标、吴兴海.
苹果锈果类病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了基于寄主植物症状及基因组特征的苹果锈果类病毒检疫鉴定方法.本标准适用于可能带有苹果锈果类病毒的植物材料的检测鉴定.
2位器设备、用具及试剂
2.1仪器设备
电子分析天平（0.001g）、垂直电泳槽、小型离心机、台式冷冻离心机、普通PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳系统、pH计、凝胶成像系统、4℃冰箱、超净工作台、一80C超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、涡旋振荡器、微波炉等.
2.2用具
可调移液器（2.5μL 10μL 20pL，100 μL 1 000 pL)吸头、离心管（0.2 mL 0.5 mL 1.5mL）及研钵等.
2.3试剂
除有特殊说明外，试验用试剂均为分析纯或生化试剂.
R-PAGE试剂见附录B；RT-PCR试剂见附录C：实时荧光RT-PCR试剂见附录D.
3检测方法
3.1R-PAGE测定
R-PAGE测定见附录B.
3.2RT-PCR 检测
RT-PCR检测见附录C.
3.3实时荧光RT-PCR检测
实时荧光RT-PCR检测见附录D.
4结果判定
样品经第3章中任意两种不同原理的方法检测为阳性，即可判定样品带有ASSVd.
GB/T 31804-2015
5样品保存与结果记录
5.1样品保存
结果判定为阳性的样品应妥善保存，并作好登记和标记，以备复核用.保存期满后，需经灭活处理.
5.2结果记录
完整的试验记录要包括：样品的来源、种类、时间，试验检测时间，地点、方法和结果，并有试验人员的签字；R-PAGE测定应有银染色结果图片，RT-PCR检测应有电泳结果图片，实时荧光RT-PCR检测应有扩增曲线结果图片.
附录A
苹果锈果类病毒相关资料
A.1背景资料
A.1.1苹果锈果类病毒基本信息
中文名称：苹果锈果类病毒.
学名：Apple scar skin viroid .
缩写：ASSVd
异名：苹果斑纹类病毒（Daple apple viroid）、梨锈皮类病毒（Pear rusty skin viroid）、Japanese pearfruit dimple viroid Apple* sabi-ka* virus 和l Manshu ringo sabi-ka byo.
分类地位：马铃薯纺锤块茎类病毒科（Pospiuiroidae），苹果锈果类病毒属（Apscaviroid）.
传播途径：可通过嫁接、病健根系自然接触及带毒繁殖材料传播.
A.1.2方法原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率的差异进行往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（return-polyacrylamidegel 根据ASSVd在寄主植物上的症状进行初步判定；根据RNA自然状态和变性后的不同结构分子在electrophoresis.R-PAGE）检测；根据其核酸序列的特异性进行常规PCR或实时荧光PCR检测，通过电泳条带大小或扩增曲线的变化进行结果判定.
A.2寄主范围
仅限于蔷科（Rosaceae）的苹果属（Malas）和梨属（Pyrus）植物很多苹果栽培品种能用作该类病毒的繁殖寄主.
A.3地理分布
世界：美国、印度、日本、加拿大、英国、意大利、阿根廷及波兰等国家和地区.中国：江苏、安徽、山东、辽宁、新疆和陕西等苹果主产区.
A.4基因组特征
ASSVd为一共价闭合环状的单链RNA分子，长约330bp，分子质量为1.1×10u.
A.5症状
A.5.1锈果型症状：先从幼果果顶部出现淡绿色水渍状斑块，而后向果梗扩展成木栓化锈斑与纵纹（见图 A.1) .A.5.2花脸型症状：病果在着色前无明显变化，着色后果面表现红绿相间的花脸状（见图A.2）.
