中华人民共和国国家标准
GB 31614.3-2026
食品安全国家标准
食品中β-羟基-β-甲基丁酸钙的测定
中华人民共和国国家卫生健康委员会 国家市场监督管理总局 发布
食品安全国家标准
食品中β-羟基-β-甲基丁酸钙的测定
1范围
本标准规定了食品中-羟基-3-甲基丁酸钙含量的液相色谱测定方法. 本标准第一篇适用于食品中3-羟基--甲基丁酸钙含量的测定.本标准第二篇适用于β-羟基-3-甲基丁酸钙原料中3-羟基-β-甲基丁酸含量的测定.
第一篇食品中β-羟基-B-甲基丁酸钙的测定液相色谱法
2原理
试样经水或甲醇水溶液提取，固相萃取柱净化后，C：反相液相色谱柱分离，紫外检测器检测，以色谱峰保留时间定性，外标法测定其中3-羟基-g-甲基丁酸的含量，进而折算为3-羟基-3-甲基丁酸钙 （CHOCaH;O）的含量.
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
3.1试剂
3.1.1乙睛（CHCN)：色谱纯.3.1.2甲醇（CHOH）：色谱纯.3.1.3盐酸（HC1)：质量分数36%~38%，3.1.5磷酸二氢钾（KHPO）. 3.1.4二氯甲烷（CHCL）：色谱纯，3.1.6磷酸（HPO）.3.1.7氨水（NHHO):25%~28%.
3.2试剂配制
3.2.1磷酸二氢钾缓冲溶液（0.02mol/L）：称取2.72g磷酸二氢钾，用800mL水溶解，用磷酸调pH值至3.0，用水稀释至1000ml.混匀.3.2.20.005%盐酸甲醇溶液：吸取0.05ml盐酸，用甲醇定容至1000mL，混匀.3.2.30.5%盐酸甲醇溶液：吸取0.5mL盐酸，用甲醇定容至100mL.混匀.3.2.45%氨水溶液：吸取5mL氨水，用水定容至100mL，混匀.3.2.580%甲醇水溶液：吸取80mL甲醇，用水稀释至100mL，混匀.
3.3标准品
p-羟基-3-甲基丁酸（CHO，CAS号：625-08-1)：纯度≥99%的标准品或其溶液.
3.4标准溶液配制
3.4.13-羟基-β-甲基丁酸标准储备液（50.0mg/mL）：准确称取0.5gβ-羟基-3-甲基丁酸标准品（精确至0.0001g），加水溶解并用水定容至10mL，混匀后转移至棕色玻璃瓶中.于0℃～4C避光密闭保存，有效期3个月.3.4.2β-羟基-g-甲基丁酸标准中间液（10.0mg/mL）：准确吸取标准储备液2.00mL于10mL容量瓶 中，加水稀释至刻度.临用现配.3.4.3p-羟基-β-甲基T酸标准中间液（1.00mg/mL）：准确吸取标准中间液（10.0mg/mL)1.00mL于10mL容量瓶中.加水稀释至刻度.临用现配.3.4.53-羟基-3-甲基丁酸标准系列工作液：分别准确吸取3-羟基-3-甲基丁酸标准中间溶液 10mL容量瓶中，加水稀释至刻度.临用现配.（0.500mg/mL)1.00mL、标准中间溶液（1.00mg/mL)1.25mL、2.50mL、5.00mL、标准中间溶液（10.0mg/mL)1.25mL、2.50mL、5.00mL于25ml容量瓶中，加水稀释至刻度，得到质量浓度分别为0.0200 mg/mL 0. 0500 mg/mL、0. 100 mg/mL 0. 200 mg/mL、0. 500 mg/mL 1. 00 mg/mL 和2.00mg/mL的3-羟基-3-甲基丁酸标准系列工作液.临用现配.
3.5材料
3.5.1水相微孔滤膜：0.45pm3.5.2强阳离子交换固相萃取柱：500mg/6ml，或性能相当者. 3.5.3强阴离子交换固相萃取柱：500mg/6mL，或性能相当者.
4仪器和设备
4.2天平：感量为0.0001g和0.01g. 4.1液相色谱仪：配紫外检测器.4.3涡旋混合器.4.4超声波清洗器.4.5离心机；转速≥10 000r/min. 4.6氮吹仪.4.7pH计：精度为0.01.4.8固相萃取装置，4.9高速粉碎机.4.10匀浆机. 4.11水平振荡器.
5分析步骤
5.1试样制备
液体样品混匀，含气样品使用前超声除气：半固体样品用组织匀浆机匀浆均匀：固体样品用高速粉2
碎机充分粉碎并搅拌均匀：糖果、巧克力及其制品等粘性较大的样品先一18C冷冻后经高速粉碎机粉 碎或剪碎均匀.制备好的试样于0℃～4℃冷藏保存.
5.2试样提取
5.2.1液体、半固体或固体类试样
称取1g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，加人10mL水，混匀，振荡5min，以8000r/min25mL容量瓶中，残渣再用10mL水提取一次，合并两次提取液，用水定容至25mL，混匀，待净化. 离心5min（若上清液浑浊，加人2mL二氯甲烷，混匀，以8000r/min离心5min），上清液转移至
巧克力及巧克力制品、可可制品：称取1g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，加人2mL二氯甲烷，混匀溶解，加入10mL水，混匀，振荡5min，以8000r/min离心5min.上清液转移至25mL容量瓶中，残渣再用10mL水提取一次，合并两次提取液，用水定容至25mL，混匀，待净化.
解，冷却至室温后，加人2mL二氯甲烷，混匀，振荡5min.以8000r/min离心5min，上清液转移至 胶基糖果和软糖：称取1g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，加人10mL50C热水，混匀溶25mL容量瓶中，残渣再用10mL水提取一次，合并两次提取液，用水定容至25mL，混匀，待净化.
5.2.2特殊医学用途配方食品、运动营养食品、调味品类试样
称取1g（精确至0.01g）试样于锥形瓶中，加人20mL水，涡旋混匀，加人40mL甲醇混匀（蛋白樟、蛋白粉、蛋白质组件等试样需直接加人80%甲醇水溶液60mL提取），超声提取5min，转移至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，取适量试样提取液至离心管中，10000r/min离心5min，上清液待净化.
5.3试样净化
5.3.1液体、半固体或固体类试样
取强阴离子交换固相萃取柱，依次用5mL甲醇、5mL水活化.准确移取2.5mL待净化液，加人5mL5%氨水，混匀后过柱，待样液滴完后，依次用5mL水、5mL0.005%盐酸甲醇溶液淋洗，弃去淋洗液.用6ml.0.5%盐酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液移取1mL水至洗脱液中，混匀置于40C水浴中，氮气吹至小于1.0mL，用水定容至1mL，涡旋混匀，经滤膜过滤后，供液相色谱分析.
注：净化过程，全程控制流建1滴/s.以上试样检测前，可先参考标签含量，试样大于1g/100g时、待净化液稀释后 再上柱净化.
5.3.2特殊医学用途配方食品、运动营养食品、调味品类试样
出液，再加2mL待净化液，控制流速1滴/s，收集流出液，经滤膜过滤后，供液相色谱分析. 取强阳离子交换固相萃取柱，依次用5mL甲醇、5mL水活化.移取3mL待净化液过柱，弃去流
5.4空百试验
除不加试样外，采取完全相同的分析步骤、试剂和用量，进行同批次操作.
5.5仪器参考条件
5.5.1色谱柱：C，250mm×4.6mm（内径），5m（粒径），或相当者.5.5.2流动相A：乙睛；流动相B：0.02mol/L磷酸二氢钾溶液（pH3.0）.梯度洗脱程序见表1.5.5.3柱温：30C5.5.4流速：1.0 mL/min
5.5.5检测波长：208mm.5.5.6进样量：10pL.
表1梯度洗脱程序
时间/min 流动相A/% 流动相B/%0 0 2 9817 0 2 9817 5 60 4021.0 60 4021 5 2 9835 0 2 86
5.6标准工作曲线的制作
将标准系列工作液分别注人液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准系列工作液中3-羟基--甲基丁酸的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线.β-羟基-3-甲基丁酸标准溶液的 液相色谱图参见附录A中图A.1.
5.7试样溶液的测定
将试样溶液注入液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准工作曲线得到待测液中3-羟基-3-甲基丁酸的质量浓度.如果待测物质含量超过标准工作曲线范围，需对试样溶液稀释后进行检测.
6分析结果的表述
x={-p)xVxf×100
式中：
X 试样中β-羟基-β-甲基丁酸钙的含量（以β-羟基-β甲基丁酸计），单位为克每百克（g/100g）；P 试样溶液中β-羟基-3-甲基丁酸的质量浓度，单位为毫克每毫升（mg/ml）； 空白溶液中3-羟基-3-甲基丁酸的质量浓度，单位为毫克每毫升（mg/ml）；v 试样的最终定容体积，单位为毫升（ml）：f 稀释倍数：100 单位换算系数： 试样取样量，单位为克（g）；1 000- -单位换算系数.
试样中测得的β-羟基-β-甲基丁酸含量乘以换算系数1.237，即得3-羟基-3-甲基丁酸钙（CH8O CaHO）的含量.
计算结果保留三位有效数字.
