NY
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 4821-2025
A hexa-plex PCR method for simultaneous detection ofvirusescausingporcine reproductive disorders
中华人民共和国农业农村部 发布
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由农业农村部畜牧兽医局提出.
本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口.
本文件起草单位：江苏省农业科学院、贵州大学、扬州大学、常熟市畜禽屠宰检疫和城区动物防疫中心，
本文件主要起草人：谢星、郝飞、曾智勇、庞茂达、刘文博、冯志新、陈蓉、李洋静、张磊.
引言
猪繁殖障碍疫病是一类以母猪和公猪繁殖性疾病为特征的传染病，引起妊娠母猪流产、死胎、本乃伊胎、弱仔、畸形胎、产仔数低，母猪发情障碍、返情、不孕，公猪精液品质下降等，给生猪养殖造成严重经济损失.在猪场常发的病毒性繁殖障碍疫病中，以猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2 型（PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）和日本脑炎病毒（JEV）等病原较为常见.这些病原感染所致的临床症状类似，且常呈混合感染给疫病的临床诊断和净化造成较大困难.
本文件针对PRV、PPV、PCV2、PRRSV.CSFV和JEV6种病毒，建立一种在一个反应体系中可同时鉴别出6种病毒单一或混合感染的经济适用的多重PCR检测方法，为临床准确检测提供标准化、规范化 的操作方法.
猪繁殖障碍性病毒六重PCR检测方法
1范围
本文件规定了猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和日本脑炎病毒的六重PCR检测方法和操作程序.
本文件适用于对引起猪繁殖障碍的病毒进行检测.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本 文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3. 1
猪繁殖障碍性病毒viruses causingPorcine reproduetive disorders
（PPV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪癌病毒（CSFV）和日本脑炎病毒 可引起母猪、公猪繁殖障碍相关疾病的病毒.临床上，以猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（JEV)6种最为常见.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.
CSFV:猪瘟病毒(classical swine fever virus)DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid)JEV:日本脑炎病毒（japanese encephalitis virus)PCV2：猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2) PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）PPV：猪细小病毒（porcine parvovirus)PRRSV：猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus)PRV：伪狂犬病病毒（pseudorabies virus）)RNA:核糖核酸（ribonucleic acid)TCID：组织半数感染量（tissue culture infective dose 50%）
5样品采集、处理、保存和运输
5.1仪器设备
5.1.1高压或煮沸的剪刀、摄子、解剖刀具等解副器材.5.1.2组织匀浆机或研钵.5.1.3超声波裂解仪.
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5.1.4高速冷冻离心机.
5.2试剂材料
5.2.1PBS溶液. 5.2.2一次性无菌注射器（5mL、10mL）及针头：真空采血管：棉签：无菌离心管（2mL、10mL）；无菌密封袋或密封容器：工作服；一次性手套；采样记录单；记号笔；防水标签；封口膜；冰袋.
5.3样品采集和处理
5.3.1样品采集
样，各病原待检样品优先级按照表1. 在样品采集处理过程中，应戴好一次性手套、口罩和防护帽.样品采集按NY/T541规定的方法采
表1临床样品采集列表
病原 样品采集病死猪：扁桃体、淋巴结、胰脏、脾脏，回肠、肝脏和胃脏CSFV 活猪：血清、扁桃体PCV2 濒死猪、扑杀的育肥猪和流产胎儿：肺脏和落巴结 仔猪：心脏活猪：血清PRRSV 濒死猪、扑杀猪：肺脏、脾脏、淋巴结、扁桃体 公猪精液活猪：血清、口腔液、扁桃体PRV 病死或剂杀猪：脑组织（含三叉神经节），扇桃体 活猪：血清、鼻拭子、扁桃体公猪精液PPV 流产胎儿、木乃伊胎的实质器官：如心、肝、脾、肾、肺 流产母猪：阴道分泌物活猪：血清 JEV 病死猪及流产胎儿：脑组织（选大脑皮质、脑干、中脑、海马回及桥脑） 病死公猪：肿账或萎缩的异常聚丸活猪：血清脑脊髓液
5.3.2样品处理
5.3.2.1血清：待2mL血液凝固后取上清放于离心管中，4℃3500r/min离心取血清.5.3.2.2精液：取精液0.5mL，冻融2次或超声波裂解，10000r/min离心10min，取上清液. 5.3.2.3组织：取待检组织样本2.0g于灭菌的组织研磨器中充分研磨后，加人适量的PBS溶液，制成混悬液，4℃3000r/min离心15min，取上清液转入无菌离心管中，对样本进行编号.5.3.2.4拭子：拭子样品悬浮于1mLPBS溶液中，混匀成悬浮液.5.3.2.5实验室培养物：取实验室培养物0.5mL.冻融3次，10000r/min离心10min，取上清液.5.3.2.6流产胎儿、木乃伊胎的实质器官：去掉表面筋膜，用研钵研碎，加人灭菌PBS制成1：5的悬液，5.3.2.7流产母猪的阴道分泌物：用无菌棉拭子轻轻旋转插人流产母猪阴道2cm~4cm刮取阴道内 加入1%青链霉素，4C过夜处理，冻融3次，3000r/min离心10min，取上清液.
容物，阴道拭子放入离心管，用2mL灭菌PBS浸润，反复挤压后，3000r/min离心10min，取上清液.
5.4保存与运输
2℃C~8℃下24h内完成运送工作.如样品不能被及时送到实验室，应置于-20C以下保存.具体样品 将采集的样品随冰袋或干冰一起放人送样箱，密封后，使用75%酒精对送样箱表面进行消毒，于保存与运输参照NY/T541操作.
6六重PCR方法
6.1仪器设备
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