中华人民共和国国家标准
GB 4789.12-2025
食品安全国家标准
中华人民共和国国家卫生健康委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准代替GB4789.12-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验》.
本标准与GB4789.12-2016相比，主要变化如下：
增加了术语和定义：增加了梭菌实时荧光PCR鉴定方法：修改了标准名称；修改了范围；一修改了检验程序、操作步骤、结果与报告及附录. 修改了设备和材料、培养基和试剂：
食品安全国家标准
食品微生物学检验 产肉毒毒素梭菌及肉毒毒素检验
1范围
本标准规定了食品中产肉毒毒素梭菌及肉毒毒素（botulinum neurotoxin）的检验方法.本标准适用于食品中产肉毒毒素梭菌及肉毒毒素的检验.
2术语和定义
产肉毒毒素梭菌
生肉毒毒素的一类细菌的统称.包含肉毒梭菌（Clostridiam botulinum）、丁酸梭菌（Clostridiumbu-tyricun）等.
3设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下.
3.2天平：感量0.1g、0.001g- 080818~.213.3pH计、pH比色管或精密pH试纸.3.4无菌剪刀、镊子、试剂勺.3.6离心机：3000g、14000g. 3.5均质器或无菌乳钵.3.7厌氧培养装置：厌氧培养箱、厌氧罐、厌氧袋或提供同等厌氧效果的装置.3.8恒温培养箱：36℃士1℃、28℃士1℃.1001081091963.10显微镜：100×~1000×. 3.11普通PCR仪和实时荧光PCR仪.3.12普通电泳仪或毛细管电泳仪.3.13凝胶成像系统或紫外检测仪.3.15微量移液器及配套灭菌吸头：2μL、10μL、20xL、100yL、200μL、1000 μl. 3.14核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.3.16无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1 mL刻度）、25mL（具0.1mL刻度）.3.17无菌锥形瓶：100mL3.18培养Ⅲ：直径90mm.3.20无菌滤器：滤膜孔径0.45pm、0.22μm 3.19离心管：1.5mL、5 mL、50 mL
3.21PCR反应管.3.22无菌注射器：1mL.3.23小鼠：体重15g~20g.每一批次试验应使用同一品系单一性别的KM（昆明）或ICR小鼠，同性别小鼠个体间体重相差不超过平均体重的士20%，且如是雌性动物应未交配、未妊娠.
4培养基和试剂
除另有规定外，PCR试验所用试剂为分析纯或符合生化试剂标准，培养基制备用水应符合GB4789.28中的要求.4.2应肉培养基：见A.2. 4.1生理盐水：见A.1.4.3胰蛋白酶胰蛋白陈葡萄糖酵母膏肉汤（TPGYT）培养基：见A.3.4.4卵黄琼脂培养基：见A.4.4.5哥伦比亚血琼脂培养基：见A.5. 4.6明胶磷酸盐缓冲液：见A.6.4.7磷酸盐缓冲液（PBS）：见A.7.4.8革兰氏染色液：见A.8.4.9胰蛋白酶：活力为1：250或0.25%.4.10肉毒毒素诊断血清：混合型、A型、B型、E型、F型. 4.111mol/L氢氧化钠.4.121mol/L盐酸.4.13无水乙醇和95%乙醇.4.1410mg/mL溶菌酶溶液.4.1510mg/mL蛋白酶K溶液. 4.163mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）.4.17TE缓冲液.4.18引物和探针：临用时用灭菌超纯水或TE缓冲液配制成浓度为10μmol/L.4.19 10×PCR 缓冲液;0.5 mmol/L KC10.1 mmol/L Tris-HC1 (pH 8.3)、0 015 mmol/L MgCl 4.20 25 mmol/L MgCl .4.21dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP 浓度均为 10 mmol/L 4.22Taq DNA聚合酶：5 U/L4.23琼脂糖：电泳级.4.24溴化乙锭、Goldview或其他核酸染料. 4.255XTBE或10×TAE缓冲液.4.266×加样缓冲液.4.27DNA分子质量标准：涵盖目标条带长度.
5检验程序
产肉毒毒素梭菌及肉毒毒素检验程序见图1.
注：报告（一)：样品中未检出或检出（某型别）肉毒毒素；报告（二)：样品中未检出或检出产（某型别）肉毒毒索梭菌：报告（三）：样品中未检出或检出产（某型别）肉毒毒素的某种梭菌.
图1产肉毒毒素梭菌及肉毒毒素检验程序
6操作步骤
6.1样品制备
固态、半固态及难吸取的液态食品，以无菌操作称取25g，放人无菌均质袋或无菌乳，块状食品以无菌操作切碎.含水量较高的食品加人25mL明胶磷酸盐缓冲液，乳粉、牛肉干等含水量低的食品加入50mL（或更多，稀释液体积可根据样品水分含量酌情增减，一般稀释至可接种即可）明胶磷酸盐缓冲液，浸泡30min，用拍击式均质器拍打1min~2min或用无菌研样研磨制备样品匀液，收集备用.
易吸取的液态食品摇匀后取25mL备用.
注：取样后的剩余样品放2℃～8C冷藏保存，直至检验报告发出后，检出阳性的样品采用压力蒸汽灭菌方式进行无害化处理，建议121C高压蒸汽灭菌30min以上.
