中华人民共和国国家标准
GB 4789.41-2016
食品安全国家标准
食品微生物学检验 肠杆菌科检验
中华人民共和国 国家卫生和计划生育委员会 发布
食品安全国家标准
食品微生物学检验肠杆菌科检验
1范围
本标准规定了食品中肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的检验方法. 本标准第一法适用于肠杆菌科含量较高的食品中肠杆菌科的计数：第二法适用于肠杆菌科含量较低食品中肠杆菌科的计数.
2术语和定义
在给定条件下发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌.
2.3最可能数most probable number;MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法.
3设备和材料
3.1恒温培养箱：36C土1℃. 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.2冰箱：2℃~5℃.3.3水浴箱：46C±1℃.3.4天平：感量0.1g. 3.5显微镜：10倍~100倍.3.6均质器.3.7振荡器.3.8无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头. 3.9无菌锥形瓶或等效容器：容量150mL.500mL.3.10无菌培养Ⅲ：直径90mm.3.11无菌试管：18mm×180mm15mm×150mm.3.12pH计或pH比色管或精密pH试纸.
4培养基和试剂
4.1缓冲蛋白陈水（BPW）：见B.1.
6操作步骤
6.1样品的稀释
6.1.1固体和半固体样品：称取25g样品放人盛有225mLBPW的无菌均质杯中.8000r/min~10000r/min均质1min~2min，或放人盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min~2min，制成110的样品匀液.6.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品放入盛有225mLBPW的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数6.1.3用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注人盛有9mLBPW的 量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1：10的样品匀液.无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液.6.1.4按6.1.3操作程序，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液.每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头.从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min.
6.2倾注平板和培养
6.2.1根据对样品污染状况的估计及相关限量要求，选择2个～3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种2个无菌平Ⅲ.同时，分别吸取1mLBPW加人两个无菌平Ⅲ内作为空白对照.6.2.2将10mL~15mL冷却至46C的VRBGA（可放置于46C±1C恒温水浴箱中保温）倾注于每 个平Ⅲ中.小心旋转平Ⅲ，使样品匀液与培养基充分混匀.6.2.3待琼脂凝固后，倾注一薄层同样的培养基覆盖平板表层，防止蔓延生长并使菌落特征更为明显.6.2.4待VRBGA平板上层琼脂凝固后翻转平板，36℃±1C培养18h~24h.
6.3典型菌落计数和确认
6.3.1肠杆菌科典型菌落为有或无沉淀环的粉红色至红色或紫色菌落.选取典型菌落数在15CFU~150CFU之间、无蔓延菌落生长的平板，只计数典型菌落数，菌落计数以菌落形成单位（colonyforming units CFU)表示.
6.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释2.代表一个平板菌落数.
6.3.4从每个平板上至少挑取5个（小于5个全选）典型菌落进行确认；如果有不同形态的典型菌落，则每种形态分别至少携取1个菌落进行确认.
6.3.5典型菌落的确认：
a）分别将所挑选的每一个菌落，划线于营养琼脂平板，36C士1℃培养18h～24h，挑取平板上 的菌落进行革兰氏染色镜检、氧化酶试验及葡萄糖发酵试验.b）革兰氏染色镜检：肠杆菌科为革兰氏阴性杆菌，无芽孢，大小为（0.3~1.0）μm×（1.0~6 0)μm.c）氧化酶试验：用铂/铱接种环或玻璃棒（不要用镍铬接种环）挑取单个菌落涂于浸湿氧化酶试剂
的滤纸上，滤纸的颜色在10s内变成蓝紫色，判为阳性反应.
d）葡萄糖发酵试验：用接种针挑取少许氧化酶阴性的同一个菌落，穿刺于葡萄糖琼脂内，于36C士1℃培养24h士2h，若试管内的内容物变为黄色，判为阳性反应.
6.4结果的计算
6.4.1一般原则
若有两个连续稀释度的平板典型菌落数在适宜计数范围内，按式（1）计算，示例见A.1、A.2、A.3 A.4
式中：
N-样品中肠杆菌科菌落数；∑a-确证的肠杆菌科菌落数之和；”-第一稀释度（低稀释倍数）平板个数（含确证的肠杆菌科菌落）：”：-第二稀释度（高稀释倍数）平板个数（含确证的肠杆菌科菌落）：d一稀释因子（第一稀释度）.
其中，a按式（2）计算：
***( 2 )
式中：
a---确证的肠杆菌科菌落数；-某一平板中A个菌落中被确证为肠杆菌科的菌落数，b≤A；A-某一平板中用于确认试验的菌落数；C--某一平板中典型菌落总数.
6.4.2低菌落数
若最低稀释度（包括液体样品原液）平板的典型菌落数均小于15CFU，具有确证的肠杆菌科菌落，则以确证的菌落数乘以最低稀释倍数计算.
若最低稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，或典型菌落数均小于15CFU，且无确证的肠杆菌科菌落，则以小于1乘以最低稀释倍数计算.
6.4.3特殊情况
第一稀释度平板上的典型菌落数均大于150CFU，且有确证的肠杆菌科菌落，以及第二稀释度平板上无确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在15CFU～150CFU之间，则以确证的菌落数乘以第一稀释倍数计算，示例见A.5.
乘以最低稀释倍数计算. 若稀释度的平板上典型菌落数均不在适宜计数范围内，且无确证的肠杆菌科菌落，则以小于1
7报告
7.1菌落数小于100时，以整数报告.7.2菌落数大于或等于100时，对第3位数字进行修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，采用两位有效数字.
7.3数字修约按”四舍五人”原则进行.
