中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
出口食品中骆驼源性成分的检测 实时荧光PCR法
Detection of Camelus ingredient in export food-Real-time PCRmethod
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.本标准主要起草人：吴亚君、陈颖、杨艳歌、王斌、王婷、刘鸣畅、韩建勋、黄文胜、邓婷婷. 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院
出口食品中骆驼源性成分的检测 实时荧光PCR法
1范围
本标准规定了食品中骆驼源性成分的实时荧光PCR检测方法，可以对食品中骆驼源性成分进行定性检测，在检测范围和技术指标方面可满是食品的检
本标准适用于乳品，新鲜、冷冻和加工的肉品中略驼源性成分的定性检测.本标准所规定方法的最低检出限（LOD）为0.01%（质量分数）：
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不 可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所 本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T27403-2008实验室质 量控制现范食品分子生物学检测
3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件3.1.1
骆驼 camelus
3.1.2 偶蹄目骆驼科骆驼属，包括单峰骆驼和
实时荧光PCRreal timePCR
在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累 时监控整个PCR扩增过程，实现对起始模板的定量及定性分析.
3.1.3
Ct值cyele threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定阔值时所经历的循环数.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（dcoxyribonuleoside triphosphate）CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（cetyltrithylammonium bromide）Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris（Hydroxymethyl）aminomethane] EDTA:乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetraacetic acid)
SN/T 4418-2016
Taq:水生栖热菌（Thermns aquaticus)OD：光度密度（optical density）GH：生长激素基因（growth hormone gene） Cytb线粒体细胞色素b基因（cytochrome b）
4方法提要
提取DNA，采用骆驼的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR信号，对食品中骆驼成分进行定性检测.
5试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂.实验用水符合GB/T6682的要求.试剂均用无DNA酶污染的容器分装.
5.1检测用引物和探针：骆驼源性成分扩增引物和探针、内参照引物和探针详见表1.骆驼引物扩增的靶标序列参见附录A
表1骆驼Cyrb基因序列引物探针
物种名称 引物/探针序列（5'→3'） 扩增片段长度 靶基因哺乳动物 F:CCTCAGCAGGGTCTTCACCA GH（内参照） R:TTCAGCTTCTCGTAGACNCG P FAM-CAGCCTGGTGTTTGGCACCTCGGA-TAMAR 66 bpF:ATTCTTYGCCTTCCAYTTCA骆驼 R:AGCGTATGCGAAYAGGAART dq 208 CyrbP:(FAM)-CCTACACGAAACAGGYTCTAATAACCCGAC-(TAMRA)
5.2 三氯甲烷（氯仿）.
5.3异丙醇.
5.4CTAB 提取液;20 g/L CTAB 1.4mol/L NaCl 0.1 mol/L Tris-HCI.0.02 mol/L NaEDTA pH8 0
5.5CTAB沉淀液：5g/L CTAB.40 mmol/LNaCl pH8.0.
5.6酚-三氯甲烷-异戊醇溶液：按照Tris饱和酯：三氯甲烷：异戊醇溶波体积比为25：24：1进行配制.
5.7三氯甲烷-异戊醇溶液：按照三氯甲烷：异戊醇溶液体积比为24：1进行配制.
5.870%乙醇（体积分数）.
5.9NaCl溶液（1.2mol/L).
5.10蛋白酶K（20mg/ml）.
5.11实时荧光PCR反应混合液：12.5pl.反应体系包括：1U~2U（Unit，酶学单位）的Tag酶、1×PCR buffer、2.5 mmol/L 的 Mg²、0.2 U UNG 、0.2 mmol/L 的 d(A C G)TPs 0.2 mmol/L.dUTP、400nmol/LROX染料（某些荧光PCR仪不需要ROX校正）.
6仪器设备
6.2核酸蛋白分析仅或紫外分光光度计. 6.1实时荧光PCR仪.6.3恒温箱.6.4离心机：离心力≥16000g.6.5微量移液器：0.5μL~10μL，10μl~100μL.20pL~200μL.200μL~1 000pl6.6研体及粉碎装置. 6.7涡旋震荡器.6.8pH计：精度0.01.6.9离心管：50mL、15mL、2mL、1.5ml6.10PCR管.6.11天平：感量0.01mg.
7检测步骤
7.1样品处理方法
将肉制品和奶片等固状待检样品研磨混匀，分装三份，其中一份为检样，另外两份为留存样品.液状样品直接分装.
7.2DNA提取
7.2.1肉制品样品
称取100mg肉制品于2mL离心管中，加人1mL.CTAB提取液，加人100μg蛋白酶K，65C温育1h，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加入适量CTAB提取缓冲液：取出后12000g离心10min.转移上清至2mL离心管中，加人等体积的室温酯-三氧甲烷-异戊醇（25：24：1）颠倒混匀，12000g转速下离心10min：转移上清至另一灭菌的离心管中，加人等体积的三氯甲 烷-异戊醇（24：1），颠倒混匀，室温下12000g离心10min：转移上清至干净离心管中，加人等体积的CTAB沉淀液混匀，室温沉淀1h；加人0.8倍体积的异丙醇或2倍体积-20C冰箱中预冷的无水乙醇混匀，-20C敢置30min，12000g4℃离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g4℃离心10min，弃上清，室温下晾干.加人50pL双蒸水，室温10min，混匀，-20C保存.
7.2.2乳制品样品
量取20mL液态乳于50mL离心管中（乳片称取2g于15mL离心管中），加人等体积的CTAB提取液（乳片加入5mL）.加人2mg蛋白酶K（乳片加人500pg）；65“C温育1h，期间不时震荡混匀，取氯甲烷，充分震荡混匀，室温下12000g离心10min；加入等体积CTAB沉淀液混匀，4C过夜沉淀，用 混匀，室温下12000g离心10min.转移上清至另一灭菌的2mL离心管中：再次加人0.7倍体积的三13000g的转速离心10min：弃上清，加人350pL1.2MNaCI溶液，充分溶解沉淀：加人0.8倍体积的异丙醇或2倍体积-20C冰箱中预冷的无水乙醇混匀，-20C放置0.5h~1h.12000g转速下4℃离心10min~15min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次.12000g转速下4℃离心10min，弃上清，室 温下晾干.加人50ul双蒸水，溶解沉淀，一20C保存.
