中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 1151.5-2003
对虾杆状病毒（BP）检测方法
Protocol of detection for Beculorirus penoei
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前盲
本标准是采用O1E的（水生动物健康手册32000年级的检疫规程， 本标的附录A是性陶录.本称准由国家认证认可监督管理委员会民出并街口， 本标准起草单位：中华人民共和国保携出人境检验检疫局，本标准主要配车人，江育林、陈有购、插净水、实秀态.
对虾杆状病毒（BP）检测方法
本标准现定了用直接是据续装检和用聚合酶链式反应（PCR）技术检图对虾杆状病毒的方法. 本标水适用于对寿托状病毒的签定及本病的孩行病学调查，非断、检疫和监树.
2规范性引周文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是饮目期的引用文件，其随后的修改单（不包据助误的内容）或修订版均不适用于本标座，然面，致助板题本标准这成持议的各方薪充 是否可使用这类文件的最新原本，凡是不注日期的引用文件，其最新息本适用于本标准，
GB/T 65821992分析实验室用水规格和试验方提（eqv ISO 3696 1987) GB/T18088一2000高人境动物检疫采样SN/T 1151.32002爽节对虾开批病靠(MBV)董方接
3试别和材料
3.1阳性病毒DNA：由OIE参考实验室提供或由图家质量置督检验检疫总局指定的实验室提供.3.3Taq腾：一20℃保存，不要反复冻随收温皮测我变化. 3.2水：应符合G/T64821992中→级水的现格.3 4 dNTP S dCTP dGTP 4ATP dTTP 各 10 mmsl/L 3.5引物，有二对引物可选用，使用时能度为40μmol/L，其序列如下：BP1F;5′-GAT-CTG-CAA-GAG-GAC-AAA-CC-3′ BP1R;5'-ATC-GCT-AAG-CTCTGG-CAT-OC3′F8 HB基BI中B 560 bp 片段 BP2R 5'-ATC-CTG-TTT-CCA-AGC-TCT-GC-3*F增 H M基W 中的 SB0 l 片& BP2F:5'-TGT-TCT-CAG-CCA-ATA-CAT-CG-I′3.6并内账：分析死使用前预冷到一20℃. 3.7物要求无DNA酶和RNA.3.9那品级冲渡，按使用说明书中规定的比例与样品祝合. 3. 8DNA 分子量标指(Marker)
4器材和设备
4.1PC3扩理仪4.2电仪. 4.3款量移限新及发失.4.4紧外积察灯， 4.5世盈培箱，4.6香通冰都和低国冰精， 4.7电动匀累据.4.9高心机和有心管. 4.8香通显微境，4 10剪刀级子.
5直楼光学层批银检查
5.1原理
在研族整中形成的有特征性的三角形包量体. 非后的（鲜活的，医死的或有视伤的）对好的肝族，或者用农集到的典便样品做醒压片，我账BP
5.2新解阳职温片活
须是品虾，取出肝展服，动体在解到键下样肝族原携岛，置于载玻片上，小心地别备压片，用相差成亮视野显费锁检查，在肝族疫中最的是压片中，妇果民察到上皮组胞的较内有单个成多个四买 的包猫体，就可以诊断为BP感案，包抛体业目面体或全字塔形，从金字塔底部到顶邮的尺寸为0.1μm~20μm之间，大多数看直时长度为8μm~10pm，可与MBV的球形包提体明量区分开来.
可以按所SN/个1151.3一2002中的方法保组积切片后进行光镇锁检包加体.
5.3真便检查
共便检查可在不票死对好的情况下栓置对断是否带有BP，该方法适用于推虾成大一些的对好-在用非致死方接检查有经济价值的亲好时特别运用，把对师放在水氯箱、产师箱或其他合道的水箱中待数小时，宜到水底部出现费使.用整料红很管取排型物，改在我璃离心管中，把典便制成湿片，直 接用显微镜检查包涵体，BP的包热体是明显的带折射的四面体-高度在0.1μm~20μm之间.
6聚会酶链式及皮（PCR）
6.1#品
用收集到的粪便样晶，取活的对虾所族服或保存在好为的乙整中的对虾肝胰腺样品都可以用作PCR相别的棋析.
6.2DNA技摄
现牙签或微量张管头把样品分款开来，神品在暖冲模里被分款后，60℃加热1h，然后95℃处理10min 12000g离心2min.把上清液移到一个新的微量管中，然后置于冰上保存.
每取800yL情化后的样品，在含有样品的真心管中加人400xL推握液1（见是录A），宽分提匀30 s 12000 r/min高心5 mim，取上层水额（均700pL），再加人650yL推提被2（见魔录A)，充分提匀30s 12 000 r/min 爽5 min-取上层水相(帅 600 pL) 开排人1.5 倍排8的元求乙醇(特 900 pL). 例置数次混匀后，20℃.8h以上以院浆技酸，12000r/mim离心30s 开去上清.干.后加10pL元
6.3PCR
用PCR检别BP时.每个抽要样品要显3min，使DNA变性然后放在冰水中选速疗即、航后他冲道（见胞录A)10pL.25mmel/L的氨化键（MgCl)10pL.水到总体积为100pL每管加人 50pL物油，短时间低速高心让矿物推量中在上层，再界反应管置于PCR扩增仪，94℃下处理反应温合物3min后，开始30个衡对（顿酸变他94°℃.1 min引物退水60℃、1mim，延72℃1min）.然后 72℃下延伸5min，最后4℃保器，合成特PCR反应产物可通过2%琼图糖电银与标准分子量进行比较.
6.4立对路
毒的对虾肝胰腺组例或荷便作为阳性对展（可以星已如的病事DNA核酸）.取心知得性的对好肝胰腺 在6.1中的样品姓理过程中必须设立阳性群品对肤别性特备对、空自对账.取已知含有BP房运织或费便作为别性对照，取等体积的水代格视板作为空白对预.
6.5星脂输电泳
入水平电泳理，使电缓冲链刷好改脱面，拨比例将样品和种品暖冲额图合点样.在电源时设立 用TBE电源缓时液（无脂录A）配2%的维脂糖（含0.5ng/mLEB，期录A）子板，将平板放DNA标准分子量 Markar作对册，推募使用pUC19 DNA/Msp I （HpeI).5V/m 电球约0.5 h，当 澳酸盛到达底部时带止，在累外灯下或核融管.
7果判促
别性对图和空白对照我有该核服特，持舞样品电球后在和应位置上有带者为阳性，无零成带的大小不 PCR后用性对照会出现一条560b（高用指物BP1时）成S80b（药用引物BP2时）的DNA片段.对的为回性，
用上述任例一种方法（如所银腺组积的驱片压片继或典便条的湿片披或PCR）都可以对BP感染作出确诊，因为P在肝孩腺中形成的包颁体银明显并且形志位星特异性，用光领直被成察新样品， 减键检需定并些常规影备们片的科品容对以容看到它们.
