SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3449—2012 昆虫介体中植原体检疫鉴定方法 Detection and identification of candidatus phytoplasma in insect vector 2012-12-12发布 2013-07-01实施 ① 中华人民共和国 发布 涂真优 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3449-2012 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草. 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口. 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁夏出入境检验检疫局. 本标准主要起草人：赵文军、陈岩、杨毅、杨旭光、牟海青、朱水芳. 1 SN/T3449-2012 昆虫介体中植原体检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了昆虫介体中植原体的检疫和鉴定方法. 本标准适用于进出境及国内监测中同翅目和半翅目（具刺吸式口器）昆虫体内植原体的检疫和 鉴定. 2原理 根据传播植原体的昆虫介体种类（参见附录A)及植原体的分子生物学特性进行鉴定. 3仪器和试剂 3.1仪器设备 PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超 低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、移液器、电泳仪、凝胶成像系统. 3.2主要试剂 甘油、75%乙醇、无水乙醇、冰醋酸、三氯甲烷、卡诺固定液（无水乙醇：冰醋酸：三氯甲烷=6：1：3）、 昆虫保存液(75%乙醇，1%甘油)、PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、Tag DNA聚合酶、引物、TAE电泳缓冲 液、DNA相对分子质量标准、SYBR Green I等. 4检测鉴定方法 4.1昆虫的前处理 昆虫饥饿处理12h 以防止昆虫肠道内食物DNA的污染. 4.2昆虫体内植原体基因组DNA提取 昆虫体内植原体基因组DNA的提取方法（见附录B). 4.3巢式PCR扩增及凝胶电泳检测 用两对植原体扩增通用引物进行巢式PCR扩增并进行凝胶电泳检测（见附录C). 4.4虚拟RFLP指纹图谱检测 见附录D. 5结果判定 5.1在4.3检测中，若用通用引物R16F2/R16R2进行第二轮PCR后，PCR扩增产物经凝胶电泳检 1 ...
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