NY
中华人民共和国农业行业标准
NY/T4642-2025
蜂王浆中酮胺类糖化蛋白的测定 分光光度法
Determination of keto-amine glycosylated proteins in royal jellySpectrophotometricmethod
中华人民共和国农业农村部 发布
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和编写起草规则3的规定起草.
请注意本文件某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由农业农村部畜牧兽医局提出.
本文件由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274）归口.
本文件起草单位：中国农业科学院蜜蜂研究所、江苏蜂奥生物科技有限公司、广西梧州甜蜜家蜂业有限公司、上海森蜂园蜂业有限公司.
本文件主要起草人：张红城、张勇、乔江涛、黄忠连、于富民、孔令杰、董捷.
蜂王浆中酮胺类糖化蛋白的测定分光光度法
1范围
本文件描述了蜂王浆中酮胺类糖化蛋白含量测定的分光光度法.本文件方法的检出限为3mg/g，定量限为10mg/g. 本文件适用于蜂王浆中酮胺类糖化蛋白的测定.注：结果以蜂王浆蛋白中所含1-脱氧-1-喝琳-D-果糖（DMF)的质量计.
2规范性引用文件
仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本 下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB9697-2008蜂王浆
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3. 1
酮胺类糖化蛋白keto-amine glycosylated proteins
具有酮胺类结构的糖化蛋白.
注：在蜂王浆中一般由还原糖通过非酶促褐变与蛋白质产生醛亚胺，再通过amadori重排反应形成酮胺类糖化蛋白.其酮胺类结构与DMF一致.
4原理
试样中酮胺类糖化蛋白在碱性条件下还原氯化硝基四氮唑蓝（NBT），生成蓝紫色甲类化合物，在530nm处有最大吸收，吸光度与酮胺类糖化蛋白成正比，根据DMF标准曲线，计算蜂王浆蛋白质中酮胺类糖化蛋白的含量.
5试剂或材料
除非另有说明，仅使用分析纯试剂.
5.1水：GB/T6682，三级水.5.2碳酸盐缓冲液（0.1mol/L.pH10.8)：准确称取无水碳酸钠9.45g、碳酸氢钠0.84g于1000mL烧杯中，用水溶解定容至1000mL容量瓶中，于2℃～8℃C保存，有效期3个月.5.3TritonX-100溶液（0.02%pH10.8)：准确量取1mLTritonX-100(30%）溶液于烧杯中 用碳酸盐缓冲液（5.2）稀释成1500mL.现配现用. 5.4DMF标准储备溶液（6mmol/L)：准确称取37.40 mg的 DMF(CAS号：6291-16-3，纯度≥98%）于25mL容量瓶中，用水溶解定容，于2C～8℃保存，有效期3个月.5.5NBT储备溶液（0.5mmol/L pH 10.8);准确称取102.20mg的NBT于250mL容量瓶中，用碳酸盐缓冲液（5.2）溶解并定容，在2℃～8℃条件下储存于棕色瓶中，有效期3个月.5.6标准系列溶液：分别取DMF 标准储备溶液（5.4）OpL、20μL、50pL、100pL、150 yL、200zL至6支试管中，用水补足至1000pL.配制成DMF浓度分别为0mmol/L、0.12mmol/L、0.3mmol/L、
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0.6mmol/L0.9mmol/L、1. 2mmol/L的标准系列溶液.
6仪器设备
6.1分光光度计：精度土2nm.6.2恒温水浴锅：精度土1℃.6.3分析天平：感量0.01 g和0.01 mg.6.4涡旋混匀器.
7样品
将蜂王浆充分搅择均匀；对于冷冻的供试样品，在25C下完全解冻后，搅拌均匀.分出约50g作为试料，置于样品瓶中，密封，并标明标记.
取样后应立即试验.如不能及时试验，应在一18℃冰箱中冷冻保存.
8试验步骤
8.1蜂王浆中蛋白质含量测定
按GB9697一2008中5.4的规定测定蜂王浆中蛋白质含量的质量分数.
8.2试样溶液制备
平行做两份试验.试样解冻至25℃，用玻璃棒搅拌均匀，准确称取1g（精确至0.01g）样品，用水充分溶解并定容至200mL，待测.
8.3标准曲线的绘制
分别取系列标准溶液（5.6）各100L于6支10mL试管中，再分别加人2mL57℃预热的NBT（5.5）和2mLTritonX-100溶液（5.3），涡旋混匀.于57C水浴中反应20min，以标准曲线0mmol/L为空白，在530nm波长下测定其吸光度.以DMF浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线.
8.4空白试样溶液制备
（5.3）涡旋混匀.于57℃水浴20min. 精密吸取100zL试样（8.2）至10mL试管中，加人2mL57℃预热的水和2mL TritonX-100溶液
8.5试样测定
精密吸取100 μL试样（8. 2)至10mL试管中，分别加人2mL 57C预热的NBT(5.5）和2mLTritonX-100溶液（5.3）涡旋混匀.于57C水浴中反应20min，以空白试样溶液（8.4）为参比，在530nm波长处测定吸光度.
9试验数据处理
试样中酮胺类糖化蛋白的含量以蜂王浆蛋白中所含DMF的质量计.以w（mg/g）表示，结果按公式（1）计算.
m×Ω
式中：
通过DMF标准曲线计算所得待测样对应的DMF的浓度，单位为毫摩尔每升（mmol/L);249.26DMF的摩尔质量，单位为每摩尔（g/mol）； V 一试样定容体积，单位为升（L）；试样的质量，单位为克（g）；Ω 蜂王浆中蛋白质质量分数，单位为百分号（%）；测定结果以平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字.
