中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T4849.2-2017
出口食品及饮料中常见小浆果成分的 检测方法实时荧光PCR法 第2部分：树莓
Identification of the ingredients of mon small berry fruitsin food and juice for export-Real-timePCR method-Part 2:Raspberry
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
部分：第1部分：蓝莓：--第3部分：黑加仑： -第2部分：树莓；第4部分：桑葚；-第5部分：蔓越莓和蓝莓；-第6部分：猕猴桃.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本部分为SN/T4849的第2部分.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院.
SN/T4849《出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光PCR法》系列标准共分为6
本部分主要起草人：吴亚君、陈颖、杨艳歌、邓婷婷、黄文胜、刘鸣畅、王斌、张九凯、韩建助.
出口食品及饮料中常见小浆果成分的 检测方法实时荧光PCR法 第2部分：树莓
1范围
实时荧光PCR法，
SN/T4849的本部分规定了出口食品及伙料中树莓成分的检测方法
本部分适用于鲜果、冷冻果、蜜饯 鲜榨果汁、果肉型果汁、混蚀汁、果 于、果酱、及其他以树莓为原辅定方法的红树莓最低检出限（LOD）为1%（体积比），黄树每和黑树得的最低检出限（LOD）为0.1%（体 料的食品及饮料中树莓成分的定性检测（清汁及果酒除外）包括红树莓、黄树莓、黑树莓.此部分所规积比）.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件 仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分于生物学检测
GB/T27657-2011树莓
3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件3.1.1
小浆果smallberyfruits
浆果是指由一个子房或联合其他花器发育成的柔软多汁的肉质单果，由一个或几个心皮形成.小浆果则泛指果实较小、多汁的一类蒙果.
3.1.2
树莓raspberry
根据GB/T27657-2011描述，树莓是蔷薇科悬钩子属植物的果实，聚合果，形状有圆头形、圆锥形和半球形等，根据颜色分为红树莓（Rubus idaeus）、黄树莓（Rubuszamhocarpus）、黑树莓（Rubusocci-dentalis）、紫树莓（Rubusneglectus）4个种群.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）
PCR：聚合酶链式反应（polymerase chainreaction）
Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数
SN/T 4849.2-2017
dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleoside triphosphate）dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate）dCTP：脱氧胞苷三确酸（deoxycytidine triphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosine triphosphate)UNG：尿略啶N-糖基化酶（uracil N-glycosylase） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidine triphosphate）CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（cetyltrithylammonium bromide）Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris（Hydroxymethyl）aminomethane]EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetraacetic acid）OD：光度密度（opticaldensity） Taq：水生栖热菌（Thermus aquaticus）
4方法提要
取DNA.以树莓果实为阳性对照，以其他水果DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照，使用特异性 果实样品直接粉碎离心，果汁样品直接离心，提取沉淀DNA，果干、果酱、密战先用蒸馏水清洗再提引物探针进行实时荧光PCR扩增，通过实时荧光信号曲线判定是否存在树莓成分.
5试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求，试剂均用无DNA酶污染的容器分装.
5.1检测用引物和探针：树莓成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见表1.树莓引物扩增的靶标序列参见附录A.
表1树莓序列引物探针
扩增片物种名称 引物/探针序列（5'→3） 段长度 靶基因F GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA内参照 R;AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA 138 bp NADH dehydrogenase subunit B(ndkB)geneP:FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1F GTTATTCGTTGGAACCGTAGGAA NADH debydrogenase树莓 R:GACTGAAAAAACTGCATTTGTGA 160 bp （ndhF)geneP:FAM-ATTATCCAAATTGTTAACCOCGTOCATAAAOCT-TAMAR
5.2三氯甲烷（氯仿）.5.3异丙醇. 5.4 CTAB 提取缓液:20 g/L CTAB 1.4 mol/L NsC1 0.1 mol/L Tris-HCl 0.02 mol/L NaEDTA pH 8 0 5.5CTAB沉淀液：5 g/L CTAB，40 mmol/L NaCl.5.670%乙醇（体积分数）.5.7NaC1溶液（1.2mol/L).
