T/SDYY251-2026
美红’苹果主要病毒病快速鉴定与高效脱 除技术规程
Technical code for rapid identification and efficient elimination of major viraldiseases in‘Meihong'apple
山东园艺学会 发布
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由山东园艺学会提出并归口.
本文件起草单位：山东农业大学、山东省果树研究所、山东省烟台市农业科学研究院、山东烟富农业科技有限公司、烟台大为苗木有限公司、烟台市蓬莱区果业技术推广中心.
本文件主要起草人：王楠、徐同尧、于蕾、刘文军、邹琦、陈学森、张宗营、尹成苗、李林光、王海波、何晓文、宋来庆、赵玲玲、王平、马明德、孙英杰、王继秋、徐月华、季兴禄.
“美红’苹果主要病毒病快速鉴定与高效脱除技术规程
1范围
本文件规定了“关红”苹果的病毒病快速鉴定技术、病毒病高效脱除技术以及无毒苗木繁育的技术要求.
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2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用面成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
NY 329-2006 苹果无病毒母本树和苗木NY/T1085-2006苹果苗木繁育技术规程NY/T2719-2015苹果苗木脱毒技术规范
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语与定义.
4病毒病快速鉴定技术
4.1病毒病类型
苹果病毒病可划分为潜隐性与非潜隐性两大类型.生产实践中，针对“美红”苹果需重点检测的病毒种类包括锈果类病毒（Apple scar skin viroid，ASSVd）、坏死花叶病毒（Apple mosaic vinus，ApMV）、褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）、茎沟病毒（Apple stem grooving virus，ASGV）及茎痘病毒（Apple stem pitring virus，ASPV）.
4.2待测样品总RNA的提取
利用植物总RNA提取试剂盒提取待检测样品的总RNA.
4.3RT-PCR引I物设计
按照附录A的序列进行引物设计.
4.4RT-PCR扩增体系
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25 μL体系：cDNA 1 μL，2 × Rapid Taq Master Mix 12.5 μL，上游引物和下游引物（10 μM）各 1 μL，ddH;O 9.5 μL.
4.5RT-PCR反应程序
95°℃预变性30s，变性15s：茎痘病毒54°℃、茎沟病毒58°℃、褪绿叶斑病毒59°℃、铸果类病毒58°℃、坏死花叶病毒58°℃退火15s，72°℃延伸30s循环35次；72°C延伸10min
4.6琼脂糖凝胶电泳检测
检测过程中同步设置阳性与阴性对照，具体操作如下：采用浓度为1%的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，上样体积5uL～8uL，电泳缓冲液选用1xTAE体系：电泳时将仪器调至恒压模式，电压设置为154V，电泳时长保持在18min～25min，错助凝胶成像系统拍照记录电泳结果.结果判定标准为：若样品条带与阳性对照目的条带一致，则为阳性，携带病毒：若样品未出现对应目的条带，则为阴性，表明样品未携带病毒.
5病毒高效脱除技术
5.1离体植株无菌体系的建立
按照NY/T2719-2015的规范要求进行幼芽脱毒处理：将处理后的幼芽接种至灭菌的初代培养基中，配方为MS5.1g/L~5.3g/L琼脂30g/L蔗糖，pH值调至5.8：接种后置于人工气候室培养，培养条件为温度25±2°℃、光照强度3000Ix、光照时长16h/d.培养约20d后，外植体即可萌动生长，以此建立离体植株的无菌营养繁殖体系.
5.2继代培养
在无菌条件下，将成功入瓶的试管苗转移至继代培养基中，配方为：MS0.1mg/LIBA0.5mg/L6-BA琼脂5.1g/L~5.3g/L蔗糖30g/L，pH=5.8，经过30d后可产生大量丛生芽.
5.3超低温处理
将继代培养的带毒离体植株转接至MS6-BA1.0mg/mLIBA0.2mg/mL培养基中，培养20~25d，选取再生芽中的单芽进行病毒检测，明确植株的带毒状态.选取株高1.0～2.0cm再生芽，在超净工作台上分割为单芽后，接种至含MS0.4mol/L蔗糖0.4mol/L甘油的培养基中，进行2d预培养.随后在解剖镜下剥取茎尖，放入60%玻璃化溶液PVS2中，于25°℃条件下处理20min：随即转入经配方优化的玻璃化溶液PVS2（成分为MS30%甘油15%乙二醇15%二甲基亚0.4M蔗糖，pH调至5.8），在0°C环境中处理100min，期间更换1次PVS2溶液：之后迅速投入液氮中保存70min.
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从液氮中取出茎尖，立即置于40°C水浴中90s，再用1.2M蔗糖培养液处理10min，洗涤1次，直至茎尖漂浮于培养液表面即可.
5.4病毒抑制剂处理
将洗涤后的茎尖放置含利巴韦林20ug/L~25ug/L茎尖分化培养基上暗培养7d.然后转移至光照强度30001x培养.30d后根据茎尖生长情况更换带有病毒抑制剂的培养基.待苗长至3cm时，取叶片进行病毒RT-PCR检测.经检测不含病毒后，该植株即可确定为无病毒母株.
5.5无病毒母株生根培养
脂20g/L蔗糖，pH值调至5.8.培养20d~25d，待组培苗根系长度达1.0cm~2.0cm、根数不少于3条时，即可开展炼苗操作.
5.6无病毒母株炼苗
炼苗流程：先将生根组培苗置于自然光环境下炼苗2d：第3d拧松组培瓶瓶盖，第4d完全揭开瓶盖，每日早、中、晚各喷施清水1次：第5d用镊子取出组培苗，放入清水中清洗培养基残留.炼苗全程需置于室内背阴处，避免阳光直射及强通风环境.
5.7无病毒植株的移栽
经炼苗的无病毒组培苗，先用70%甲基托布津800倍液浸泡30s，再以湿润水草包裹组培苗基部1cm处，移栽至72孔育苗穴盘，将穴盘移入温室内的小拱棚中，棚顶覆盖塑料薄膜并加盖遮阳网，棚内湿度保持在65%~70%、温度维持在25±3°℃.培育2周后拆除塑料薄膜和遮阳网，让幼苗适应棚内环境.再经3d适应性培养，将成活的组培苗转入50孔加深育苗穴盘，置于温室培育.育苗基质采用进口草炭土与蛭石按3:1的比例混配.
5.8脱毒品种母本圃的建立
按照NY329-2006的规范要求，建立脱毒品种母本圃.
6无病毒苗木繁育
按照NY/T1085-2006的规范要求进行无病毒苗木繁育，从脱毒品种母本圃采集无病毒接穗，嫁接在无病毒砧木上，进行双脱毒苗木繁育.
