中华人民共和国水产行业标准
SC/T9451-2025
Determination of the diversityofmicrobial munity structurein thesediment of freshwater ponds by denaturing gradientgelelectrophoresismethod
中华人民共和国农业农村部 发布
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出.
本文件主要起草人：孙盛明、戈贤平、胡红浪、朱健、张成锋.
淡水池塘底质微生物菌群结构多样性测定变性梯度凝胶电泳法
1范围
材料、仅器设备、样品、试验步骤、数据处理. 本文件描述了用变性梯度凝胶电泳法测定淡水养殖池塘底质微生物菌群结构多样性的原理、试剂和
本文件适用于淡水养殖池塘的底泥微生物菌群结构多样性检测.
2规范性引用文件
仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本 下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T24769工业用丙烯酰胺 GB/T32725实验室测定微生物过程、生物量与多样性用土壤的好氧采集、处理及贮存指南SC/T9102.3渔业生态环境监测规范第3部分：淡水
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3. 1
变性梯度凝胶电泳denatured gradient gel electrophoresis DGGE
根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统.
4原理
首先提取样品总DNA，再利用PCR扩增DNA样品中的16SrDNA基因片段，扩增的DNA片段通过变性处理，使其变性梯度凝胶电泳分离.已经扩增和变性的DNA样品通过电泳在凝胶中移动并形成DNA条带，对变性梯度凝胶进行染色和可视化，可以观察到不同的DNA条带，每个DNA条带代表一个具有特定DNA序列的微生物.通过比较不同样品中的DNA条带，可以推断微生物群落的差异和结构.
5试剂和材料
警示-一丙烯酰胺具有神经毒性，按照GB/T24769规定的注意事项和保存事项操作.
除非另有说明，在分析中仅使用分析纯及以上的试剂，以及符合GB/T6682规定的一级水.
5.1试剂
5.1.1氯化钠（NaCI). 5.1.2丙烯酰胺（CHNO).5.1.3双丙烯酰胺（CHNO）.5.1.4蛋白酶K（C:HO).5.1.5氢氧化钠（NaOH）.5.1.6过硫酸铵（HNO S).5.1.7十二烷基硫酸钠（SDS）.5.1.8尿素（CHN;O）.
SC/T 9451-20255.1.9硝酸银（AgNO）.5.1.10十六烷基三甲基澳化铵（CTAB）.5.1.11三羟甲基氨基甲烷（Tris).5.1.12乙二胺四乙酸（EDTA）. 5.1.13琼脂糖：电泳级.5.1.14氯仿（CHCL）.5.1.15异戊醇（C;HO）.5.1.16异丙醇（C HO）5.1.17乙酸（CHO）.5.1.18乙醇(CHO）.5.1.19四甲基乙二胺（TEMED). 5.1.20甲酰胺（CHNO)；去离子.5.1.21福尔马林：含37%~40%甲醛.5.1.22盐酸（HCI)：优级纯浓度36%.5.1.23脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP），2.5mmol/L.5.2材料5.2.1Tris-HCl：称取121g三羟甲基氨基甲烷（5.1.11），加 800mL水溶解后，用盐酸（5.1.22）调节溶液pH至8.0 加水定容至1L.5.2.2EDTA溶液：称取372.2g乙二胺四乙酸（5.1.12)，加约800mL水溶解后，用盐酸（5.1.22）调节 溶液pH至8.0，加水定容至1L.5.2.3DNA抽提缓冲液：分别称取12.11g三羟甲基氨基甲烷（5.1.11）、7g氯化钠（5.1.1）、7.464g乙二胺四乙酸（5.1.12）和20g十六烷基三甲基溴化铵（5.1.10），加约900mL水，用盐酸（5.1.22）调节溶液pH至8.0 加水定容至1L.5.2.510%SDS：称取100g十二烷基硫酸钠（5.1.7）缓慢加人含有0.9L水的烧杯中，搅拌直至完全溶 5.2.4蛋白酶K溶液：称取0.2g蛋白酶K（5.1.4）.溶于10mL水中，储存于-20℃下备用.解，加水定容至1L.5.2.6氯仿-异戊醇（1：24）；在通风橱中，量取240mL异戊醇（5.1.15）缓慢加入10mL氯仿（5.1.14）中，混匀.5.2.775%乙醇溶液：量取750mL乙醇（5.1.18)缓慢加人200ml水中，摇匀，加水定容至1L.5.2.950×TAE缓冲液：分别称取242g三羟甲基氨基甲烷（5.1.11）和37.2g乙二胺四乙酸（5.1.12）， 5. 2.8TE缓冲液：分别吸取 10 mL Tris-HC1(5. 2. 1)和1mL 1 mol/1 EDTA溶液（5 2.2）混合均匀.吸取57.1mL乙酸（5.1.17），加水溶解并定容至1L，现用现配.5.2.101×TAE缓冲液：吸取20mL50×TAE缓冲液（5.2.9）.加980mL水稀释，现用现配.5.2.111%琼脂糖凝胶：称量1g琼脂糖（5.1.13）于锥形瓶中，加人100mL1×TAE缓冲液（5.2.10），轻摇混匀后微波炉中火加热至沸腾，取出摇匀.5.2.1240%丙烯酰胺溶液；称取38.93g丙烯酰胺（5.1.2)，1.07g双丙烯酰胺（5.1.3)于100 mL棕色5.2.1310%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵（5.1.6）.加水溶解并定容至10mL，现用现配. 容量瓶中，加水至60mL，加热溶解，加水定容至100mL.5.2.1435%变性梯度凝胶：称取2.94g尿素，分别吸取4mL40%丙烯酰胺溶液（5.2.12）、0.4mL50×TAE缓冲液（5.2.9)、2.8mL甲酰胺(5. 1.20) 120μL10%过硫酸铵溶液（5.2.13）和10L四甲基乙二胺（5.1.19），混合均匀，加水至20mL.5.2.1555%变性梯度凝胶：称取4.62g尿素，分别吸取4mL.40%丙烯酰胺溶液（5.2.12)、0.4ml 2
