中华人民共和国国家标准

GB/T15670.28-2017部分代替GB/T15670-1995

农药登记毒理学试验方法 第28部分：慢性毒性与致癌合并试验

Toxicological test methods for pesticides registration-Part 28:Combined chronic toxicity/carcinogenicity study

中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

前言

GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：

第1部分：总则；第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法：第3部分：急性经口毒性试验序贯法； 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；-第6部分：急性吸人毒性试验；第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验；第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验； 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；一第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验：第13部分：亚慢性毒性试验； 第14部分：细菌回复突变试验；一第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；-一第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第18部分：嘀齿类动物显性致死试验： 一第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验：第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验：第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验：第23部分：致畸试验； 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验：第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；第27部分：致癌试验； 第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第28部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本部分部分代替GB/T15670-1995《农药登记毒理学试验方法》.修改和调整了总体结构和编排格式：修改了对实验动物的要求（见6.2.2，1995年版的19.3.2）. 修改了对受试物的要求（见6.1，1995年版的19.5.1）：

本部分与GB/T15670-1995的慢性毒性与致癌合并试验部分相比主要变化如下：增加了一些章节内容（见第1章、第2章、第3章、第5章、6.2.3、6.5.3、第7章和第8章）；

GB/T 15670.28-2017

本部分由中华人民共和国农业部提出.本部分由中华人民共和国农业部种植业管理司归口.本部分起草单位：农业部农药检定所.本部分主要起草人：王捷、陶传江、李增刚、宋宏宇、张丽英、曲蔓亮.本部分所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T 15670-1995

农药登记毒理学试验方法 第28部分：慢性毒性与致癌合并试验

1范围

GB/T15670的本部分规定了慢性毒性与致癌合并试验的基本原则、方法和要求. 本部分适用于为农药登记进行的慢性毒性与致癌合并试验.

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.

GB14925实验动物环境及设施

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件.

慢性毒性chronic toxicity

动物在正常生命周期的大部分时间内反复接触受试物所引起的健康损害效应.

3.2

未观察到有害作用剂量水平no observed adverse effect level:NOAEL

高剂量或浓度. 在规定的试验条件下，用现有技术手段和检测指标，未能观察到与染毒有关的有害效应的受试物最

观察到有害作用最低剂量水平lowestobserved adverse effect level;LOAEL

量或浓度. 在规定的试验条件下，用现有技术手段和检测指标，观察到与染毒有关的有害效应的受试物最低剂

3.4

靶器官target organ

受试物引起机体出现显著毒性效应的器官.

化学致癌作用chemicalcarcinogenesis

化学致癌物chemicalcarcinogen

能使机体产生肿瘤、肿瘤发生率增加或肿瘤潜伏期缩短的化学物质.

4试验目的

在动物的大部分生命周期内，将受试物反复给予实验动物，同时观察对实验动物的慢性毒性作用和

GB/T 15670.28-2017

化学致癌作用，确定慢性毒性的未观察到有害作用剂量水平（NOAEL）、观察到有害作用最低剂量水平（LOAEL）和致癌的可能性.

5试验概述

实验动物在正常生命周期的大部分时间内反复经口、经皮或经呼吸道给予不同剂量的受试物，染毒期间每天观察动物各种体征，定期称量体重和摄食量，并进行眼科、血液生化指标、血液学指标、尿液指标、组织病理学检查指标等的测定，以评价受试物的慢性毒性，同时观察动物的肿瘤出现的数量、类型、发生部位及发生时间，评价受试物有无致癌性.

6试验方法

6.1受试物

根据受试物的特性或试验目的，可将受试物混人何料、饮水给予.开始试验前应有足够数量的受试物，应使用同一批生产的受试物.如不能一次提供足够量的受试物，不同批次受试物的含量等要一致.

测定受试物在饲料或饮水中的含量或浓度、稳定性和均一性.浓度应在理论浓度的土15%以内. 如果受试物掺在饲料或饮水中染毒，要将受试物与水或饲料混匀并保证该受试物配制的稳定性，应

经皮和吸入途径染毒，常以原药形式染毒，如制备困难可加入赋形剂，但应考虑其毒性和剩激性，对经皮染毒还应考虑赋形剂对受试物皮肤通透性的影响.

6.2实验动物

6.2.1种属和等级

慢性毒性与致癌合并试验可选用大鼠、小鼠等，首选大鼠，使用其他动物应说明理由.啮齿类实验动物等级应为无特定病原体动物（specificpathogen-free animal SPF）.

6.2.2动物性别、年龄、数量和试验期限

后于试验前适应环境5d~7d，适应期应进行检疫观察，开始试验前应对动物的肿瘤自发率有一定了 实验应选用雌、雄两种性别的动物.断乳后的健康动物，晒齿类动物周龄为4周~6周.动物购买解.大鼠慢性毒性与致癌合并试验期限为104周，每组动物不少于160只，雌雄各半，应在26周、52周和78周各剂量组计划解剖20只（雌雄各半）.小鼠慢性毒性与致癌合并试验进行78周，每组动物不少于140只，雌雄各半，应在26周、52周各剂量组计划解剖20只（雌雄各半）.每组动物体重差异不超过同性别平均体重的土20%.试验结束时各剂量组每种性别的动物能满足统计学要求（哦齿类动物每组 每性别动物应不少于10只）.

如果低剂量或对照组动物存活率只有25%时，可以结束试验.如两性别死亡有明显差异，其结束的时间可以不同.个别情况下因受试物毒性明显面造成高剂量组动物过早死亡，此时不应结束试验.

6.2.3饲养环境设施条件

本试验应在屏障系统内（barriersystem）进行.实验动物的环境设施应符合GB14925对相应等级动物的规定.

每一房间只能饲养一种动物，每一房间只供一种受试物试验用（除非有证据表明不同受试物对动物无影响），也应考虑受试物对对照组动物的影响.

2 笼具等物品应便于消毒和清洁，约每2周更换一次.应避免使用消毒剂和农药等，特别是与动物有

中华人民共和国国家标准

GB/T15670.27-2017部分代GB/T15670-1995

农药登记毒理学试验方法 第27部分：致癌试验

Toxicological test methods for pesticides registrationPart27:Carcinogenicity study

中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

前言

GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：

第1部分：总则；第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法；第3部分：急性经口毒性试验序贯法； 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；第6部分：急性吸人毒性试验；第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验；第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验； 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验；第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验；第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验：第13部分：亚慢性毒性试验； 第14部分：细菌回复突变试验；一第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；-一第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第18部分：嘀齿类动物显性致死试验： 第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验：第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验：第23部分：致畸试验； 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验：第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；第27部分：致癌试验； 第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第27部分.本部分部分代替GB/T15670-1995《农药登记毒理学试验方法》. 本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本部分与GB/T15670-1995的致癌试验部分相比主要变化如下：-修改和调整了总体结构和编排格式：增加了一些章节内容（见第1章、第2章、第3章、第5章、6.2.3、7.2.3和第8章）；修改了对实验动物的要求（见6.2.2，1995年版的17.3.3）. 修改了对受试物的要求（见6.1，1995年版的17.5.1）：

GB/T 15670.27-2017

本部分由中华人民共和国农业部提出.本部分由中华人民共和国农业部种植业管理司归口.本部分起草单位：农业部农药检定所.本部分主要起草人：王捷、陶传江、李增刚、宋宏宇、张丽英、曲蔓亮.本部分所代替标准的历次版本发布情况为： *GB/T 156701995

农药登记毒理学试验方法 第27部分：致癌试验

1范围

GB/T15670的本部分规定了致癌试验的基本原则、方法和要求.本部分适用于为农药登记而进行的致癌试验.

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.

GB14925实验动物环境及设施

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件.

化学致癌作用chemicalcarcinogenesis

化学物质引起肿瘤发生率和/或类型增加、潜伏期缩短的效应.

化学致癌物chemical carcinogen

能使机体产生肿瘤、肿瘤发生率增加或肿瘤潜伏期缩短的化学物质.

4试验目的

通过一定的途径给予实验动物不同剂量的受试物，观察动物在接近终生的时间内肿瘤的发生情况，以评定长期接触受试物对动物的化学致癌作用.

5试验概述

出现肿瘤的数量、类型、发生部位、发生时间，以及通过组织病理学检查，闸明受试物有无致癌性. 在实验动物正常生命周期的大部分时间内将受试物反复经口、经皮或经呼吸道给予染毒，观察动物

6试验方法

6.1受试物

号），物理、化学性质，结构式，分子式和相对分子质量，受试物的储存方法、分析方法和化学稳定性等. 在开始本试验之前，应了解受试物现有的各种资料：包括受试物的商品名和其他名称（包括CAS

开始试验前应有足够数量的受试物，应使用同一批生产的受试物.如不能提供足够量的受试物，不同批次受试物的含量等要一致.

如果受试物掺在饲料或饮水中染毒，要将受试物与水或饲料混匀并保证该受试物配制的稳定性，应测定受试物在饲料或饮水中的含量或浓度、稳定性和均一性.浓度应在理论浓度的土15%以内.

经皮和吸入途径染毒，常以原药形式染毒，如制备困难可加人赋形剂，但应考虑其毒性和剩激性，对经皮染毒还应考虑赋形剂对皮肤通透性的影响.

6.2实验动物

6.2.1种属和等级

致癌试验选用大鼠、小鼠等.首选大鼠，使用其他动物应说明理由，啮齿类实验动物等级应为无特

定病原体动物(specific pathogen-free animal SPF).

6.2.2性别、年龄、数量和试验期限

试验应选用雌、雄两种性别的动物.断乳后的健康动物，嗮齿类动物周龄为4周～6周.动物购买后于试验前适应环境5d～7d，适应期应进行检疫观察，开始试验前应对动物的肿瘤自发率有一定了解.大鼠致癌试验期限为104周，每组动物不少于100只，雌雄各半.小鼠致癌试验期限应为78周，每计划提前解剖部分动物，应在试验前适当增加动物数量.试验结束时各剂量组每种性别的动物能满足 组动物不少于100只，雌雄各半.每组动物体重差异不超过同性别平均体重的土20%，如果试验期间统计学要求（晒齿类动物每组每性别动物应不少于10只）.

低剂量或对照组动物存活率只有25%时，可以结束试验.如两性别死亡有明显差异，其结束的时间可以不同.个别情况下因受试物毒性明显面造成高剂量组动物过早死亡，此时不应结束试验.

6.2.3饲养环境设施条件

本试验应在屏障系统（barrier system）内进行.动物实验的环境设施应符合GB14925对相应等级动物的规定.

每一房间只能饲养一种动物，每一房间只供一种受试物试验用（除非有证据表明不同受试物对动物无影响），也应考虑受试物对对照组动物的影响.

笼具等物品应便于消毒和清洁，约每2周更换一次，应避免使用消毒剂和农药等，特别是与动物有密切接触的部位更应注意.

饲料应满足动物营养需要，应定期分析饲料营养成分.

5%，否则会对动物正常营养产生影响. 如果受试物的毒性较低，则加入饲料的受试物比例较大，应注意混入饲料中的受试物不应超过

饮水应不含对试验有影响的污染物，应该对水质进行监测.饮水系统应定期消毒.

6.3剂量及分组

至少应设三个剂量组及一个相应的对照组.剂量选择可参考急性毒性、短期重复染毒毒性、亚慢性毒性和代谢研究等资料确定.剂量设计原则为：

a）高剂量组：高剂量组动物可以出现某些轻微的毒性反应，如体重减轻（减少程度不大于10%）等毒理参数的改变，但不能明显缩短动物寿命（肿瘤引起的除外）.剂量设计不大于1000mg/kg体重.b）低剂量组：低剂量组动物不应出现毒性效应，但剂量应高于人的实际接触水平.c）中剂量组：剂量设计应介于高剂量和低剂量之间，也可参照受试物的毒代动力学资料进行

中华人民共和国国家标准

GB/T15670.26-2017部分代替GB/T15670-1995

农药登记毒理学试验方法 第26部分：慢性毒性试验

Toxicological test methods for pesticides registration-Part 26:Chronic toxicity study

中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

前言

GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：

第1部分：总则：第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法；第3部分：急性经口毒性试验序贯法； 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法：第5部分：急性经皮毒性试验；第6部分：急性吸人毒性试验：一第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验；第8部分：急性眼刺激性/离蚀性试验； 一第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验；一第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验；第13部分：亚慢性毒性试验； 一第14部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨简嗜多染红细胞微核试验；-一第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验； 第18部分：啮齿类动物显性致死试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验：第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验：第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验：第22部分：体外哺乳动物细胞DNA报害与修复/程序外DNA合成试验； 第23部分：致畸试验；第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；第27部分：致癌试验； 第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第26部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本部分部分代替GB/T15670-1995《农药登记毒理学试验方法》. 本部分与GB/T15670-1995的慢性毒性试验部分相比主要变化如下：修改和调整了总体结构和编排格式：一修改了对实验动物的要求（见6.2.2，1995年版的18.3.3）； 一修改了对受试物的要求（见6.1，1995年版的18.6）；

一增加了一些章节内容（见第1章、第2章、第3章、第5章、6.2.3、6.5.3、第7章和第8章）；

GB/T 15670.26-2017

修改了染毒途径（见6.4，1995年版的18.5）.本部分由中华人民共和国农业部提出并归口.本部分起草单位：农业部农药检定所.本部分主要起草人：王捷、陶传江、李增刚、宋宏字、张丽英、曲亮.本部分所代替标准的历次版本发布情况为： -GB/T 156701995

农药登记毒理学试验方法 第26部分：慢性毒性试验

1范围

GB/T15670的本部分规定了慢性毒性试验的基本原则、方法和要求.本部分适用于为农药登记而进行的慢性毒性试验.

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.

GB14925实验动物环境及设施

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件.

3.1

慢性毒性chronic toxicity

动物在正常生命周期的大部分时间内反复接触受试物所引起的健康损害效应.

3.2

未观察到有害作用剂量水平no observed adverse effect level;NOAEL

高剂量或浓度. 在规定的试验条件下，用现有技术手段和检测指标，未能观察到与染毒有关的有害效应的受试物最

3.3

现察到有害作用最低剂量水平lowestobservedadverseeffeet level;LOAEL

量或浓度. 在规定的试验条件下，用现有技术手段和检测指标，观察到与染毒有关的有害效应的受试物最低剂

3.4

靶器官target organ

受试物引起机体出现显著毒性效应的器官.

4试验目的

通过一定途径长期反复给予实验动物不同剂量的受试物，观察实验动物的慢性毒性效应、严重程度、靶器官和损害的可逆性，确定未观察到有害作用剂量水平（NOAEL）和观察到有害作用最低剂量水 平（LOAEL)），为拟定人类接触该农药的每日允许摄人量（ADI）提供依据.

5试验概述

实验动物在正常生命周期的大部分时间内反复经口、经皮或经呼吸道给予不同剂量的受试物，染毒

GB/T 15670.26-2017

标、组织病理学检查指标等的测定，以闽明受试物的慢性毒性. 期间每天观察动物各种体征，定期称量体重和摄食量，并进行眼科、血液生化指标、血液学指标、尿液指

6试验方法

6.1受试物

开始试验前应有足够数量的受试物，应使用同一批生产的受试物.如不能提供足够量的受试物，不同批次受试物的含量等要一致.

如果将受试物掺人饲料或饮水给予，要将受试物与水或饲料混匀并保证该受试物配制的稳定性，应测定受试物在饲料或饮水中的含量或浓度、稳定性和均一性.浓度应在理论浓度的土15%以内.

经皮和经呼吸道吸入途径染毒，常以原药形式染毒，如制备困难可加入赋形剂，但应考虑其毒性和刺激性，对经皮染毒还应考虑赋形剂对皮肤通透性的影响.

6.2实验动物

6.2.1种属和等级

为无特定病原体动物（specific pathogen-free animal，SPF）. 慢性毒性试验可选用大鼠、小鼠等，首选大鼠，使用其他动物应说明理由.酷齿类实验动物等级应

6.2.2性别、年龄、数量和试验期限

试验应使用雌、雄两种性别的动物.断乳后的健康动物，喘齿类动物周龄为4周～6周.动物购买少于100只，雌雄各半，应在26周、52周和78周各剂量组计划解剖20只（雌雄各半）.小鼠慢性毒性 后于试验前适应环境5d～7d，适应期应进行检疫观察.大鼠慢性毒性试验期限为104周，每组动物不试验进行78周，每组动物不少于80只，雌雄各半，应在26周、52周各剂量组计划解剖20只（雌雄各半）.试验开始时每组动物体重差异不超过同性别平均体重的士20%.试验结束时各剂量组每种性别的动物能满足统计学要求（暗齿类动物每组每性别动物应不少于10只）.

6.2.3饲养环境设施条件

本试验应在屏障系统内（barriersystem）进行.实验动物的环境设施应符合GB14925对相应等级动物的规定.

每一房间只能饲养一种动物，每一房间只供一种受试物试验用（除非有证据表明不同受试物对动物无影响），也应考虑受试物对对照组动物的影响.

笼具等物品应便于消毒和清洁，约每两周更换一次，应避免使用消毒剂和农药等，特别是与动物有密切接触的部位更应注意.

饲料应满足动物营养需要，应定期分析饲料营养成分.

如果受试物的毒性较低，则加入饲料的受试物比例较大，应注意混入饲料中的受试物不应超过5%，否则会对动物正常营养产生影响.

饮水应不含对试验有影响的污染物，应该对水质进行监测.饮水系统应定期消毒.

6.3剂量及分组

至少应设三个剂量组及一个相应的对照组.剂量选择可参考急性毒性、短期重复染毒毒性、亚慢性毒性和代谢研究等资料确定.剂量设计的原则为：

a）高剂量组：高剂量组动物可以出现某些较轻或较明显的毒性反应，个别动物可能死亡，高剂量

组剂量设计不大于1000mg/kg体重；

中华人民共和国国家标准

GB/T 15670.25-2017部分代替GB/T156701995

农药登记毒理学试验方法 第25部分：急性迟发性神经毒性试验

Toxicological test methods for pesticides registrationPart 25:Acute delayed neurotoxicity test

中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

前言

GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则：第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法；第3部分：急性经口毒性试验序贯法； 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；第6部分：急性吸人毒性试验；一第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验：第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验； 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验：第13部分：亚慢性毒性试验； 第14部分：细菌回复突变试验；一第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验：-一第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第18部分：嘀齿类动物显性致死试验： 一第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验：-第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验：第23部分：致畸试验； 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验：第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第27部分：致癌试验； 第26部分：慢性毒性试验；第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第25部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本部分与GB/T15670-1995的迟发性神经毒性试验部分相比主要变化如下： 本部分部分代替GB/T15670-1995（农药登记毒理学试验方法》.调整了总体结构和编排格式；删除了“亚慢性试验“内容（1995年版的13.5.2）；增加了对神经病靶陷酶的测定要求（见6.5.3）. 增加了一些章节内容（见第1章、第2章、第3章、第5章、6.1、6.5.3和第7章）；

GB/T 15670.252017

本部分由中华人民共和国农业部提出并归口.本部分起草单位：农业部农药检定所.本部分主要起草人：王捷、陶传江、廖雪、宋宏宇、张丽英.本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T 156701995

第25部分：急性迟发性神经毒性试验 农药登记毒理学试验方法

1范围

GB/T15670的本部分规定了急性迟发性神经毒性试验的基本原则、方法和要求.本部分适用于为农药登记面进行的急性迟发性神经毒性试验.

2规范性引用文件

件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

GB14925实验动物环境及设施

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件.

3.1

急性迟发性神经毒性acute delayed neurotoxicity

一次大量接触受试物后，早期出现神经病靶酯酶（NTE）活力抑制，此后的1周～2周内，动物逐渐出现以肢体无力和上位运动神经元癌率性瘫痪为主要表现的神经综合症，神经病理检查表现为脊髓和 周围神经远端轴索神经病.

3.2

磷酸酐、有机磷酸、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯及氨基硫代磷酸酯等，它们中的有些成员能引起迟发性神经 含碳-磷键的化合物或含有机基团的磷酸衍生物，主要包括不带电的磷酸酯、硫代有机磷酸酯、有机毒性.

3.3

神经病靶酯酶neuropathy target esterase：NTE神经毒性酯酶neurotoxic esterase

一种能催化戊酸苯酯水解的膜结合蛋白.

4试验目的

评价和了解受试物（如有机磷化合物）引起急性迟发性神经毒性的潜在能力.

5试验概述

将受试物一次以尽可能大的剂量给母鸡经口染毒.为保证有足够的动物存活满足神经生化和组织病理学检查要求，可给胆碱能作用的防护剂.观察染毒的母鸡是否有行为异常、共济运动失调及瘫痪，

GB/T 15670.25-2017

连续21d.在染毒后24h和48h，每组随机选取动物进行生化检查，特别是测定神经病靶酯酶（NTE）.在染毒后21d，处死剩余的其他母鸡，取神经组织进行组织病理学检查.

6试验方法

6.1受试物配制

所选溶剂不与受试物产生化学反应，不影响受试物的吸收. 如受试物经口染毒，需要配制成为溶液，应采用水溶液、混悬液或油溶液.应了解溶剂的毒性，并且

6.2实验动物

6.2.1动物选择：选用8个~14个月健康初成年母鸡，无步态异常，体重1.5kg~2.0kg.受试物组和 溶剂对照组每组至少12只，阳性对照组至少6只.

6.2.2动物何养条件：在常规条件下何养母鸡，单笼饲养.鸡笼应足够大，以使动物能够自由活动，并易于观察动物步态.试验开始前，动物应在试验环境中检疫、适应至少5d，正常何喂，不限制饮水，实验动物何养环境应符合GB14925的有关规定.

6.3剂量及分组

一般应设受试物染毒组、阳性对照组和溶剂对照组.

受试物染毒组的剂量通过额试验来确定.预试验时，使用适当数量母鸡和剂量水平确定正式试验剂量.母鸡或其他动物的毒理学信息历史数据有助于剂量选择. 剂量达到的最大值.预试验应引起一定的致死率，可以使用多种试验方法来估计受试物的最大非致死

在正式试验中应选择尽可能高的剂量水平，允许个别动物出现死亡，但应有足够数量的动物存活用于生化（6只）和在21d时进行组织病理学检测（6只）.可使用已知的不干扰迟发性神经毒性反应的硫酸阿托品或其他预防性药物来保护动物免于急性胆碱能效应导致的死亡.

阳性对照组应保证至少有6只母鸡（3只用于生化检验，3只用于病理解剖并做组织病理学检查）给予迟发性神经毒性阳性物：三邻甲苯磷酸酯（tri-o-cresylphosphate，TOCP）.

对于溶剂对照组，如溶剂毒性已知，可仅设溶剂对照组：溶剂毒性未知，还应增设空白对照组.

限量试验：如果受试物染毒剂量在2000mg/kg体重，未引起可观察到的毒性作用，或根据结构相关化合物的分析获得的数据估计不会产生毒性，则没有必要进行更高剂量的试验.当人体暴露水平较高表明需要进行更高剂量试验时，不能采用限量试验.

6.4染毒方式

通常采用经口途径一次染毒，包括灌胃、胶囊吞咽或咽峡部滴注等方法染毒，隔夜禁食.灌胃体积可根据各组不同剂量按5mL/kg体重给予.为对抗急性胆碱能效应所致的动物死亡，给予受试物前10min～15min，可以肌肉注射已知不干扰迟发性神经毒性反应的硫酸阿托品作保护处理，硫酸阿托品 剂量为 10mg/kg体重.

6.5观察期限及指标

6.5.1临床观察与检查

染毒后立即开始观察，并于染毒后每半小时观察一次，2d后每天观察一次，直至21d试验结束.将母鸡出现的全部中毒反应、时间、类型、轻重程度以及发现行为异常的时间详尽记录，将母鸡置于笼外观察，强迫母鸡做活动以便有利于观察到最轻微的毒效应.取出濒死的母鸡处死并进行大体解剖.

中华人民共和国国家标准

GB/T15670.24-2017部分代替GB/T15670-1995

农药登记毒理学试验方法 第24部分：两代繁殖毒性试验

Toxicological test methods for pesticides registrationPart 24:Two-generation reproduction toxicity study

中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

前言

GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：

第1部分：总则；第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法：第3部分：急性经口毒性试验序贯法； 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；第6部分：急性吸人毒性试验；第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验：第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验； 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验：第13部分：亚慢性毒性试验； 第14部分：细菌回复突变试验：一第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；-一第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第18部分：嘀齿类动物显性致死试验： 一第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验：第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验：第23部分：致畸试验； 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；第27部分：致癌试验； 第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第24部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本部分部分代替GB/T15670-1995（农药登记毒理学试验方法》. 本部分与GB/T15670-1995的两代繁殖试验部分相比主要变化如下：修改和调整了标准的总体结构和编排格式；增加了部分章节内容（见第1章、第2章、第3章、第5章、6.1、6.2.3和第8章）；一修改了剂量和分组的内容（见6.3，1995年版的16.5）： 修改了对实验动物的要求（见6.2.1995年版的16.4）；

GB/T 15670.24-2017

一修改了现察指标的内容（见6.4.4，1995年版的16.11）.本部分由中华人民共和国农业部提出并归口.本部分起草单位：中华人民共和国农业部农药检定所.本部分主要起草人：李宁、张丽英、陶传江.本部分所代替标准的历次版本发布情况为： *GB/T 156701995

第24部分：两代繁殖毒性试验 农药登记毒理学试验方法

1范围

GB/T15670的本部分规定了两代繁殖毒性试验的基本原则、方法和要求. 本部分适用于为农药登记而进行的两代繁殖毒性试验.

2规范性引用文件

件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

GB14925实验动物环境及设施

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件.

繁殖毒性reproductive toxicity

受试物引起的亲代雌性或雄性繁殖功能损伤或生殖能力下降.

3.2

发育毒性developmental toxicity

接触受试物的妊娠动物的子代在出生前、围产期和出生后所表现出的机体缺陷或功能障碍.

4试验目的

用于检测受试物对雌性和雄性动物繁殖功能的影响，如性腺功能、发情周期、交配行为、妊娠、分娩、哺乳和断乳以及子代的生长发育等.并可提供有关受试物发育毒性的信息，如出生缺陷、死亡和畸形等.

5试验概述

将雌雄动物各分成儿个剂量组，为评价受试物对精子生成的影响，染毒期限为亲代雄性动物（P）至少覆盖一个完整的精子形成周期（小鼠约56d，大鼠约70d）.亲代雌性（P）动物至少为两个完整的发 情周期.此后，交配动物（P）均给予受试物，雌性亲代妊娠期持续给予受试物直至F1代断奶.F1代断奶后持续给予受试物，从子代F1的青春期、成熟期、交配，子代F2的出生直至F2代断奶，以评价受试物的两代繁殖毒性效应.

6试验方法

6.1受试物配制

灌胃给予时，根据不同受试物的特性选择合适的溶剂或介质，通常首选溶剂为水，不溶于水的受试物可使用食用油（如橄榄油、玉米油等），不落于水或油的受试物可使用羧甲基纤维素钠、淀粉等配成混 悬液.掺人饲料给予时，要将受试物与饲料或水混匀并保证受试物配制的稳定性，应进行稳定性、含量和均一性的测定.受试物掺人饲料或水时，应不影响饲料营养质量和水的平衡，一般在饲料中的掺人量不超过何料浓度的5%.

6.2实验动物

6.2.1种属和周龄

4周～5周，试验开始时动物体重差异不应超过同性别平均体重的土20%.所用动物应注明种类、品系、 首选大鼠和小鼠.不可使用繁殖率低和/或发育缺陷发生率高的品系.常用雌雄动物为初断乳性别、体重和周龄.

6.2.2动物性别和数量

雌性和雄性动物通常按1：1或2：1比例合笼交配，每个剂量组和对照组至少能获得20只孕鼠，以评价受试物对两代动物繁殖过程的影响，包括对亲代动物繁殖能力、怀孕、妊娠行为和哺育过程的影响，对子代F1从出生到成熟期以及对子代F2从出生到断乳期生长发育的影响.

6.2.3饲养条件

实验动物饲养条件应符合GB14925的有关规定.实验期间自由饮水和摄食，妊娠动物应单笼饲养.

6.3剂量及分组

试验至少设三个剂量组和一个对照组.高剂量组应使亲代动物出现明显的毒性反应，但不引起动物的死亡，如果发生不期望的死亡，亲代动物（P）死亡率应小于10%.中间剂量可引起轻微的毒性反应，低剂量不引起亲代和子代任何毒性反应.当掺人饲料染毒时，如果食物摄人量和利用率降低，则需考虑设配对饲养对照组.

的预试验中有母体毒性但未观察到发育毒性时，则可不必设定三个剂量.对照组为溶剂对照组或介质 如果受试物毒性较低，预期在1000mg/kg体重剂量不可能对繁殖产生任何毒性影响或在高剂量对照组，除不给予受试物外，其余处理均与剂量组相同.

6.4操作步骤

6.4.1染毒途径和时间

灌胃染毒，每日灌胃一次，时间地点应相同，并定期按体重调整灌胃量，以维持染毒剂量不变.灌胃量一 根据受试物的特性或试验目的，可将受试物混人饲料、灌胃或饮水给予.首选掺人何料给予，如果般不超过10mL/kg体重各组灌胃体积一致.

动物染毒时间，以大鼠为例，初断乳4周～5周的雌雄大鼠染毒8周后进行交配，交配期最长持续2周，雌性动物妊娠、哺乳期继续染毒至仔鼠断乳为止，雄性动物染毒至交配结束为止.染毒时间见 表1.

中华人民共和国国家标准

GB/T15670.23-2017部分代GB/T15670-1995

农药登记毒理学试验方法 第23部分：致畸试验

Toxicological test methods for pesticides registration-Part 23:Teratogenicity study

中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

前言

GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：

第1部分：总则；第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法：第3部分：急性经口毒性试验序贯法； 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；第6部分：急性吸人毒性试验；第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验；第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验； 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验；第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验：第13部分：亚慢性毒性试验； 第14部分：细菌回复突变试验；一第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；-一第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验； 第18部分：嘀齿类动物显性致死试验：第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验：第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验：-第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验：第23部分：致畸试验； 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验：第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；第27部分：致癌试验； 第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第23部分.本部分部分代替GB/T15670-1995《农药登记毒理学试验方法》. 本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本部分与GB/T15670-1995的致畸试验部分相比主要变化如下：修改和调整了标准的总体结构和编排格式；增加了部分章节内容（见第1章、第2章、第3章、第5章、第6章、7.1和第9章）；一修改了剂量和分组的内容（见7.3，1995年版的15.5）： 修改了对实验动物的要求（见7.2.1995年版的15.3）；

在体表、内脏和骨骼检查项目中，删去了检查项目表格（见7.4.4.2、7.4.4.3和7.4.4.4.1995年版的15.9.3和15.9.4);一内脏和骨骼观察中，增加了观察程序、骨骼染色方法和家免内脏观察和骨骼观察的内容（见7.4.4.3 和 7 4.4.4 1995 年版的 15 9.4).本部分由中华人民共和国农业部提出并归口. 本部分起草单位：农业部农药检定所.本部分主要起草人：李宁、张丽英、陶传江.本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T 156701995

农药登记毒理学试验方法 第23部分：致畸试验

1范围

GB/T15670的本部分规定了致畸试验的基本原则、方法和要求.本部分适用于为农药登记而进行的致畸试验.

2规范性引用文件

件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

GB14925实验动物环境及设施

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件.

致畸性teratogenicity

在胚胎发育期引起子代永久性结构和功能异常的化学物质的特性.

母体毒性maternal toxicity

引起亲代雌性妊娠动物直接或间接的健康损害效应.

4试验目的

检测妊娠动物接触受试物后引起的子代致畸可能性.

5试验概述

将性成熟期的雌性动物与雄性动物进行交配，将确认怀孕的雌性动物随机分配到各个剂量组，在妊娠动物的胚胎发育器官形成期给予受试物染毒，并在子代预期出生前将母体处死，取出子宫，检查吸收胎、活胎、死胎及胎仔的外观、内脏和骨骼畸形情况.

6仪器与试剂

6.1仪器

实验室常用设备、生物显微镜及体视显微镜、游标卡尺（百分尺）等.

6.2试剂

6.2.1茜素红贮备液：茜素红饱和液（溶剂为50%乙酸）5.0mL、甘油10.0mL、1%水合氯醛60.0mL混合，放入棕色瓶中（适用于不剥皮法骨骼染色）.存于棕色瓶中， 6.2.2茜素红应用液：取贮备液3 mL~5 mL 用1 g/100 mL~2 g/100 mL氢氧化钾液稀释至 1 000 mlL 6.2.3茜素红溶液：茜素红0.1g、氢氧化钾10g.与燕馏水1000mL混合临用前配制（适用于剥皮法骨骼染色）.6.2.4透明液A：甘油200mL、氢氧化钾10g，与蒸馏水790mL混合.6.2.6固定液（Bouins液）：2，4，6-三硝基酚（苦味酸）饱和液75份、甲醛20份，与冰乙酸5份混合. 6.2.5透明液B：甘油与蒸馏水等量混合.

7试验方法

7.1受试物配制

浮于适当的溶剂或介质中，液体受试物可直接使用或稀释后使用.根据受试物的理化性质选择所用的 受试物应新鲜配制，如果有资料表明其溶液储存稳定，也可不必新鲜配制.固体受试物应溶于或悬溶剂或介质，通常首选溶剂为水，不溶于水的受试物可使用食用油（如橄榄油、玉米油等），不落于水或油的受试物可使用甲基纤维素钠、淀粉等配成混悬液.

7.2实验动物

7.2.1动物选择

验开始时动物体重差异不应超过同性别平均体重的土20%.所用动物应注明种类、品系、性别、体重和 试验首选动物为大鼠或家免.选用健康、性成熟的雄性动物和性成熟的未经交配的雌性动物，试周龄.

7.2.2动物性别和数量

动物适应5d~7d，雌性和雄性动物通常按1：1或2：1比例合笼交配，为了获得足够的胎仔来评价受试物的致畸作用，每个剂量水平的妊娠动物，大鼠至少16只，家兔至少12只.

7.2.3饲养条件

饲养， 实验动物饲养条件应符合GB14925的有关规定.实验期间自由饮水和摄食，妊娠动物应单笼

7.3剂量及分组

试验至少设3个试验剂量组、一个阴性对照组和一个阳性对照组（首次开展致畸试验的实验室或人员，应增设阳性对照组）.高剂量原则上应使部分孕鼠或孕兔出现毒性反应，如体重轻度减轻，如果母体 动物有死亡发生，应不超过母体动物的10%；低剂量组不应出现可观察到的毒性作用；在高剂量和低剂量间可按儿何级数设计中间剂量.试验剂量的设计参考急性毒性、短期重复经口染毒毒性、亚慢性毒性、人体实际摄人量等资料进行，最好通过预试验进行剂量设计，阴性对照组除不给受试物外，其余处体重）、呵斯匹林（250 mg/kg体重~300 mg/kg体重）及维生素A(7500μg/kg体重~13 000μg/kg体 理均同剂量组.大鼠常用阳性对照物为敌枯双（0.5mg/kg体重~1.0mg/kg体重）、五氯酚钠（30mg/kg2

中华人民共和国国家标准

GB/T 15670.22-2017

农药登记毒理学试验方法 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害 与修复/程序外DNA合成试验

Toxicological test methods for pesticides registrationPart 22 :DNA damage and repair/unscheduled DNA synthesis testinmammalian cells invitro

中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

前言

GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则：第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法；第3部分：急性经口毒性试验序贯法： 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；第6部分：急性吸人毒性试验：一第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验： 第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验；一第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验； 第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验；第13部分：亚慢性毒性试验；第14部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验； 第18部分：嘀齿类动物显性致死试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验；一第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验； 一第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；第23部分：致畸试验：-第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验； 第27部分：致癌试验；第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第22部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本部分由中华人民共和国农业部提出并归口.本部分起草单位：农业部农药检定所.本部分主要起草人：张宏伟、张丽英、陶传江.

农药登记毒理学试验方法 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害 与修复/程序外DNA合成试验

1范围

GB/T15670的本部分规定了体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验的基本原则、方法和要求.

本部分适用于为农药登记而进行的体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验，

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件.

2.1

程序外DNA合成unscheduled DNA synthesis;UDS

发生在细胞周期的S期半保留DNA程序合成之外的DNA合成.

2.2

净核银粒netnucleargrain：NNG

在放射自显影UDS试验中细胞内UDS活性的定量测定，计算为核银粒数（NG）减去等于核面积的细胞质内银粒平均数（CG），即NNG=NG一CG.由各细胞计算NNG数，再将一个培养物或平行培养物中的细胞NNG汇总.

3试验目的

该测试系统是通过对DNA修复合成水平的检测来评价受试物能否对原代哺乳动物细胞和已建立的哺乳动物细胞系的DNA造成损伤及损伤的程度.由于UDS反映损伤的切除修复过程，并反映出损伤的程度，因此可作为化学致癌剂短期生物学试验的判断终点.

4试验概述

将分离和培养的非S期哺乳动物细胞移入含胸腺嘧啶核昔（H-TdR）和受试物的培养瓶中，孵育一定时间后，观察H-TdR掺人情况，如某受试物造成了细胞DNA损伤，必然引起细胞的自主性DNA 修复，在修复过程中H-TdR整合人DNA链中，造成H-TdR在修复后DNA中的掺入.再用放射性自

除非采用肝原代细胞作为靶细胞，培养的哺乳动物细胞均要在加和不加外源性代谢活化系统两种情况下与受试物作用.

鉴于原代培养肝细胞存在易于分离培养、保留肝微粒体酶系等优点，建议用原代培养肝细胞作为试验的靶细胞.

5试剂与器材

5.1试剂

注：全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为双蒸水.

5.1.1细胞增殖用培养基

Eagle氏最低必需培养基（minimalessentialmedium，Eagle）85份，小牛血清15份，加人青霉素、链霉素贮存液1份，使青霉素、链霉素的最终浓度分别为100单位及100Pg/mL.EMEM培养基可选用各种商品供应的粉末培养基按生产厂商提供资料配制并除菌，4C冰箱贮存.

5.1.2同步用培养基

不含精氨酸的Eagle氏最低必需培养基（minimalessentialmedium，Eagle）98份，小牛血清2份，青霉素、链霉素浓度同细胞增殖用培养基.

5.1.3Hanks平衡盐溶液（HBSS)

贮液A：将氯化钠160g、氯化钾8g、硫酸镁（MgSO7HO）2g及氯化镁（MgCl6HO）2g溶于800mL双蒸水（50C~60C）中.另取无水氯化钙2.8g溶于100mL双蒸水中.将上述两溶液混合后，加水至1000mL，加人三氯甲烷2mL，保存于4C中.

KH;PO；2H;O)1.2g（或KH：PO0.95g）、葡萄糖20g溶解于800mL双蒸水中，加人100mL 贮液B:将磷酸氢二钠（NaHPO12HO）3.04g（或NaHPO2HO1.2g）、磷酸二氢钾0.4%酚红溶液（取酚红1g，溶于3mL1mol/L氢氧化钠中，待完全溶解后，加人双蒸水中至250mL），加水至1000mL，加人三氯甲烷2mL，保存于4℃中.

贮液C：1.4%碳酸氢钠，以双蒸水配制.

应用液的配制：取A液1份，B液1份，水18份，混合后分装于玻聘容器内，高压灭菌，4C保存.用前加人1.4%碳酸氢钠，将pH调整至7.2~7.4.

5.1.4磷酸缓冲液（无钙、镁的Dulbecco氏磷酸缓冲盐液）（pH7.4）

1000mL双蒸水中. 取氯化钠8.00g、磷酸二氢钾0.20g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠（Na:HPO；12H;O）2.89g溶于

5.1.50.02%乙二胺四乙酸二钠或四钠（EDTA）溶液

取EDTA0.2g溶于无钙、镁的磷酸缓冲液中，使成1000mL.高压灭菌后使用.

5.1.6抗菌素贮存液

取临床注射用青霉素G100万单位及链霉素1g粉针，在无菌操作下溶于100mL灭菌蒸馏水中，使青霉素及链霉素在溶液中的浓度分别为1万单位及10000pμg/mL，使用时每100mL培养基中加人抗菌素贮存液1ml.

5.1.7大鼠肝微粒体S9混合液（10%）

每10mL由以下成分组成，临用时配制：

磷酸盐缓冲液（0.2mol/L，pH7.4) 6.0 mL氯化钾溶液（1.65mol/L) 0.2 mL

氯化镁溶液（0.4mol/L) 0.2 mL6-磷酸葡萄糖溶液（0.05mol/L) 1.0 mL辅酶II（CoI）溶液（0.25mol/L) 1.6 mL肝S9液 1.0 mL混匀，置冰浴中待用.

5.1.8显影液及定影液（放射自显影用）

5.1.8.1Kodak D-170显影液

贮液：无水亚硫酸钠25g、溴化钾1g，加水至200mL.使用时用水稀释至1000mL，溶入2-氨基酚盐酸盐（amitol)4.5g.

5.1.8.2KodakD-196显影液

水（50°℃）500mL，顺次溶人米吐尔（硫酸对甲氨基苯酚）2g、无水亚硫酸钠72g、对苯二酚8.8g、无水碳酸钠48g、溴化钾4g，加水至1000mL.

5.1.8.3停显液

98%冰乙酸15mL 加水至1000mL.

5.1.8.4Kodak F-5定影液

水（50℃）100mL，依次溶人硫代硫酸钠240g、无水亚硫酸钠15g.28%乙酸48mL、硼酸（结晶）7.5g、钾砚15g，加水至1 000mL.

5.1.90.25mol/L及0.5mol/L高氯酸

70%高氯酸（售品）8.57mL，加水至100mL为1mol/L，倍比稀释至所需浓度.

5.1.10闪烁液

2，5-二苯基曝唑（PPO）5g、1，4-双-[5-苯基曝唑基-2]-苯（POPOP）300mg溶于甲苯中，配成1 000 mL.

5.2器材

5.2.1玻璃类

在自来水中将污物冲净，在肥皂或洗衣粉溶液中煮沸5min，稍冷后在热肥皂水内反复洗刷，用自来水冲洗干净.干后浸于清洁液内过夜，取出后用自来水反复冲洗12次.再用蒸馏水冲洗2次，于蒸偏水中浸泡24h.取出后用蒸馏水再冲洗2次，烘干.所用玻瓶用纸包扎瓶口，移液管及滴管在近端管 内塞入棉花栓后用纸包裹.

5.2.2橡皮类

酸煮沸10min.自来水流水冲洗2h以上.再于蒸馏水中煮沸2次，用蒸馏水冲洗后，浸泡于蒸馏水中 自来水中冲洗干净后，在肥皂水内煮沸.若为新购置的，则用4%氢氧化钠煮沸10min，再用4%盐24h，干燥后，用玻璃纸包装，置于容器内.

5.2.36号玻璃滤器（除菌用）

新购置的滤器浸人含少量亚硝酸钠的热硫酸内24h，蒸馏水抽滤后，用氢氧化钠溶液抽滤至中性，

中华人民共和国国家标准

GB/T 15670.21-2017

农药登记毒理学试验方法 第21部分：体内哺乳动物肝细胞 程序外DNA合成（UDS）试验

Toxicological test methods for pesticides registrationPart 21: Unscheduled DNA synthesis (UDS) test with mammalian liver cells in vivo

中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

前言

GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则；第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法；第3部分：急性经口毒性试验序贯法： 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；第6部分：急性吸人毒性试验：第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验： -第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验；第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验：第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验； "第13部分：亚慢性毒性试验；第14部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；一第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验； 第18部分：嘀齿类动物显性致死试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验；第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验； 一第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；-第23部分：致畸试验：第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验； 第27部分：致癌试验；第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第21部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本部分由中华人民共和国农业部提出并归口.本部分起草单位：农业部农药检定所，本部分主要起草人：张宏伟、张丽英、陶传江.

第21部分：体内哺乳动物肝细胞 农药登记毒理学试验方法 程序外DNA合成（UDS）试验

1范围

GB/T15670的本部分规定了体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成试验的基本原则、方法和要求.

本部分适用于为农药登记面进行的体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成试验.

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.

GB14925实验动物环境及设施

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件，

程序外DNA合成unscheduled DNA synthesis；UDS

发生在细胞周期的S期半保留DNA程序合成之外的DNA合成.

正修复的细胞cell in repair

净核银粒高于本实验室历史性阴性对照值的细胞.

净核银粒net nuclear grain；NNG

在放射自显影UDS试验中细胞内UDS活性的定量测定，计算为核银粒数（NG）减去等于核面积的细胞质内银粒平均数（CG），即NNG=NG-CG.由各细胞计算NNG数，再将一个培养物或平行培养 物中的细胞 NNG汇总.

4试验目的

体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验用于检测受试物对动物肝细胞诱发DNA修复的影响.

5试验概述

体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验是利用哺乳动物进行的体内体细胞遗传毒理学

试验，遗传学终点为原发性DNA损伤.

UDS反应的测定取决于DNA损伤部位切除和取代的碱基数.本试验适用于检测“长程修复”（20对~30对碱基），对“短程修复”（1对~3对碱基）的敏感性差.而且，由于DNA损伤未修复、错配修复或错复制均可引起致突变事件，UDS反应并不完全真实反映DNA修复过程.由于本试验检测整个基因组，敏感性较高，对本试验提供致突变活性的信息缺乏特异性可能有所补偿.

将新分离哺乳动物肝细胞，移人含有胸腺嘧啶核苷（H-TdR）的培养瓶中，孵育一定时间后，观察H-TdR掺人情况，如果受试物造成细胞DNA损伤，必然引起细胞的自主性DNA修复，在修复过程中H-TdR整合人DNA链中，造成H-TdR在修复中的掺人，再用放射自显影或液闪计数的方法来观察掺人H-TdR的量.掺人越多说明受试物对DNA的损伤越广泛.

6试验方法

6.1准备

6.1.1实验动物和饲养环境

一般选用健康初成年的大鼠，在试验开始时，动物体重变异应不超过同性别平均体重的土20%.选用常规何料，饮水不限制.如果受试物掺人何料进行染毒，应选择适当的饲料以保证受试物充分混合.动物可单独饲养或同性别分小组笼养，实验动物饲养条件应符合GB14925的有关规定.

6.1.2动物试验前准备

试验前动物要在实验动物房环境中至少适应5d时间.将动物随机分为受试物组和对照组.

6.1.3受试物准备

固体受试物应溶于或悬浮于适当的溶剂/赋形剂中，并于动物染毒前稀释.液体受试物可直接染毒，或在染毒前稀释.应新鲜制备受试物，除非稳定性资料证明可以贮存.

6.1.4溶剂/赋形剂

形剂，应有其相容性的资料，推荐首先考虑使用水性溶剂/赋形剂. 溶剂/赋形剂在所用剂量水平不应产生毒效应，不应与受试物反应.如使用未充分了解的溶剂/赋

6.1.5对照

每个试验都应包括同时进行的阳性对照和阴性（溶剂/赋形剂）对照.除了受试物染毒不同外，对照组动物应以与染毒组动物相同的方式进行操作.

阳性对照在暴露水平应预期得到超过本底值的UDS增加.阳性对照剂量应使效应很清楚，但并不使读片者立即发现其为阳性对照标本片，阳性对照的染毒途径可以不同于受试物染毒途径.常用的阳性对照物见表1.

表1阳性对照物

采样时间 化学物 CAS号N-二甲基亚硝胺早期采样(2 h~4 h) (N-nitrosodimethylamine NDMA) 62-75-9晚期采样（12 h~16 h) (.N -2-acetamidofluorene 2- AAF) 2-乙酰氨基荡 -96-S

6.2.1动物的数量和性别

应采用适当的动物数.每组至少有3只可供分析的动物.如已有充分的本底对照数据库，则同时进行的阴性对照组和阳性对照组仅需1只或2只动物.

如在进行本试验时，已有资料表明同一品系、相同的暴露途径，在不同性别之间毒性无差别，则用单一性别（优先用雄性）动物即可，当人暴露受试物可能有性别特异性时，可选择适当性别的动物进行试验.

6.2.2染毒程序

受试物通常采用一次染毒.

6.2.3剂量水平

剂量一般应为高剂量的50%～25%.在较低的无毒性剂量就有特殊生物活性的受试物（如激素和有丝 通常设2个剂量组.高剂量应产生毒性，如根据相同的染毒方案更高剂量可产生动物死亡，较低分裂原）的剂量设置标准要单独考虑，并应逐例评价.如无适当的资料，需进行确定剂量范围的试验，应在同一实验室利用同一品系、性别的动物和染毒方案.

高剂量也可规定为引起肝脏某些毒性（如核固缩）的剂量.

6.2.4限量试验

如果单次染毒剂量水平或同一天2次染毒达到2000mg/kg体重，不产生可观察到的毒性效应，并且根据结构相关化合物的资料预期受试物无遗传毒性，则不需要进行2个剂量水平的完整试验.如果人暴露的预期量过高，也可在限量试验中应用更高的剂量水平.

6.2.5染毒

2mL/100g体重，若利用更高体积，应说明理由.除了在较高浓度毒效应增强的刺激性或腐蚀性物质 受试物通常用灌胃染毒.如果合理，其他的染毒途径也可接受.一次胃的最大液体容积不超过外，应调整浓度使受试物容积减少，保证在的剂量水平为等容积.

6.2.6肝细胞制备

动物染毒后12h~16h制备肝细胞.如无明显的阳性反应，则进行早期采样（染毒后2h~4h）.但是，根据已有的毒物动力学资料也可利用其他采样时间.

以胶原酶原位灌注肝，分离肝细胞，贴壁后，进行哺乳动物肝细胞短期培养.阴性对照组动物的肝细胞存活率应大于50%.

6.2.7UDS测定

移去培养基后，细胞再培养在含过量未标记胸腺啶的培养液中，以除去未掺人的放射性：如培养时间较长可免去此操作.然后，细胞再经淋洗、固定、染色，计数银粒.每个动物制备2个～3个样本片.

中华人民共和国国家标准

GB/T 15670.20-2017

农药登记毒理学试验方法 第20部分：体外哺乳动物细胞基因 突变试验

Toxicological test methods for pesticides registration-Part 20:In vitro mammalian cell gene mutation test

中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

前言

GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则：第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法；第3部分：急性经口毒性试验序贯法： 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法：；第5部分：急性经皮毒性试验；一第6部分：急性吸人毒性试验：第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验： -第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验：第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验：第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验； 第13部分：亚慢性毒性试验；第14部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；一第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验； 第18部分：嘀齿类动物显性致死试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验；一第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验； 一第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；-第23部分：致畸试验：第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验； 第27部分：致癌试验；第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第20部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本部分由中华人民共和国农业部提出并归口.本部分起草单位：农业部农药检定所.本部分主要起草人：张宏伟、张丽英、陶传江.

农药登记毒理学试验方法 第20部分：体外哺乳动物细胞基因 突变试验

1范围

GB/T15670的本部分规定了体外哺乳动物细胞基因突变试验的基本原则、方法和要求.本部分适用于为农药登记而进行的体外哺乳动物细胞基因突变试验.

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.

GB/T15670.14-2017农药登记毒理学试验方法第14部分：细菌回复突变试验

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件.

野生型基因经过突变成为突变型基因的过程，这种突变可引起酶和功能蛋白的改变.

3.2碱基置换型致突变物basepair substitution mutagens引起DNA分子中一个或多个碱基对置换的物质.

3.3移码型致突变物frameshiftmutagens引起DNA分子增加或丢失一个或多个碱基对的物质.

表型表达时间phenotypic expression time

新突变的细胞耗尽改变的基因产物所需的时间.

4试验目的

缺失等，从而评价受试物引起突变的可能性. 本试验用于检测受试物对体外培养的哺乳动物细胞的基因突变作用，包括碱基对突变、移码突变和

5试验概述

本试验属正向突变试验，可检出碱基置换型致突变物和移码型致突变物.在加人和不加人代谢活化系统的条件下，使细胞暴露于受试物一定时间，然后将细胞传代培养.胸苷激酶水平正常的细胞对三 氯胸苷（trifluorothymidine，TFT）等敏感，因而在培养液中不能生长分裂，突变细胞则不敏感，在含有三氟胸苷的选择性培养液中能继续分裂并形成集落.相似的，次黄標呤乌原呤磷酸核糖基酶（HPRT）正常的细胞对6-硫代乌嘌呤（6-thioguanine 6-TG）敏感，突变的细胞则不敏感，在含有6-硫代乌嘌呤的选择性培养液中可生长形成集落.基于突变集落数，计算突变類率以评价受试物的致突变性.

6试验方法

6.1受试物和试剂

6.1.1受试物

6.1.1.1受试物的配制

固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统或用前稀释至适合浓度.受试物应在使用前新鲜配制，否则应证实贮存不影响其稳定性.

6.1.1.2溶剂的选择

溶性溶剂.二甲基亚纲（DMSO)也是常用溶剂，但使用时浓度不应大于0.5%. 溶剂应是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性.首选溶剂是水或水

6.1.1.3受试物浓度设置

6.1.1.3.1最高浓度的选择

决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗透压（osmolality）的改变.

6.1.1.3.2细胞毒性的确定

应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在活化系统存在或不存在两种条件下确定细胞毒性，例如相对集落形成率或相对细胞总生长情况（totalgrowth）.应在预试验中确定细胞毒性和溶解度.

6.1.1.3.3剂量设置

至少应设置4个可供分析的浓度.当有细胞毒性时，其浓度范围应包括从最大毒性至儿乎无毒性，通常浓度间隔系数在2~√10之间.

如最高浓度是基于细胞毒性，则该浓度组的细胞相对存活率（相对集落形成率）或相对细胞总生长情况应为10%~20%（不低于10%）

对于细胞毒性很低的化合物，最高浓度应是5pL/mL，5mg/mL或0.01mol/L.

对于相对不溶解的物质，其最高浓度应达到或超过在细胞培养状态下的溶解度限值.最好在试验处理开始和结束时均评价溶解度，因为由于S9等的存在，试验系统内在暴露过程中溶解度可能发生变化.不溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不应影响观察.

6.1.2对照

6.1.2.1一般原则

在每一项试验中，在代谢活化系统存在和不存在的条件下均应设阳性对照和阴性（溶剂）对照.

6.1.2.2阳性对照

当使用代谢活化系统时，阳性对照物必须是要求代谢活化、并能引起突变的物质，在没有代谢活化（methylmethanesulfonate，MMS，TK试验）、乙基亚硝基脲（ethyl nitrosourea，ENU，HPRT试验）等. 系统时，阳性对照物可使用甲磺酸乙酯（ethylmethanesulfonate，EMS，HPRT试验）、甲磺酸甲酯在有代谢活化系统时，可以使用3-甲基胆蕙（3-methylcholanthrene，HPRT试验，TK试验）、环磷酰胺（cyclophosphamideTK试验）、N-亚硝基胍（N-nitroso-dimethylamine，HPRT试验）、7 12-二甲基苯蕙（HPRT试验）等.也可使用其他适宜的阳性对照物.

6.1.2.3阴性对照

阴性对照（溶剂对照）除不含受试物外，其他处理应与受试物组相同.当不具有实验室历史资料证实所用溶剂无致突变作用和无其他有害作用时，应增设空白对照.

6.1.3细胞

变分析宜用小鼠淋巴瘤细胞株（L5178Y）和人类淋巴母细胞株（TK6），细胞在使用前应进行有无支原 HPRT位点突变分析宜用中国仓鼠肺细胞株（V-79）和中国仓鼠卵巢细胞株（CHO）.TK位点突体污染的检查.

6.1.4培养液

（Eagle）培养液加人10%胎牛血清和适量抗菌素.对于15178Y或TK6细胞，常用RPM11640培养液 应根据试验所用系统和细胞类型来选择适宜的培养液，对于V-79或CHO细胞，常用MEM加人10%马血清和适量抗菌素.

6.1.5活化系统

通常使用的是S9混合物（S9mix）.S9是从经酶诱导剂处理的晒齿动物肝脏获得的.S9的制备见GB/T15670.14-2017的5.7.S9的使用浓度为1%~10%（终浓度）.S9mix中所加辅助因子的量 由各实验室自行决定，但需对S9rmix的活性进行鉴定，应能明显活化阳性对照物.也可使用下述配方：

S9 0.125 mLMgCl; (0 4 mol/L) 0.02 mLKC1(1.65 mol/L) 1.791 mg 0 02 mL葡萄糖-6-磷酸 辅酶Ⅱ（氧化型，NADP) 3 061 5 mg用无血清MEM培养液补足至1ml.

6.1.6选择剂

6-硫代鸟嘌岭（6-TG）宜使用终浓度5μg/mL~10μg/mL.三氟胸苷（TFT）宜使用终浓度3 μg/mL.

中华人民共和国国家标准

GB/T 15670.19-2017

农药登记毒理学试验方法 第19部分：体外哺乳动物细胞染色体 畸变试验

Toxicological test methods for pesticides registrationPart 19:In vitro mammalian cells chromosome aberration test

中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

前言

GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则：第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法；第3部分：急性经口毒性试验序贯法： 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验：第6部分：急性吸人毒性试验：第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验： -第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验：第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验；第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验：第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验； 第13部分：亚慢性毒性试验；第14部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；一第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验； 第18部分：嘀齿类动物显性致死试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验；一第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验； 一第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；-第23部分：致畸试验：第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验； 第27部分：致癌试验；第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；-第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第19部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本部分由中华人民共和国农业部提出并归口.本部分起草单位：农业部农药检定所，本部分主要起草人：张宏伟、张丽英、陶传江.

农药登记毒理学试验方法 第19部分：体外哺乳动物细胞染色体 畸变试验

1范围

本部分适用于为农药登记而进行的体外哺乳动物细胞染色体畸变试验. GB/T15670的本部分规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、方法和要求.

2规范性引用文件

件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

GB/T15670.14-2017农药登记毒理学试验方法第14部分：细菌回复突变试验

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件.

3.1

结构畸变structuralaberration

可分为染色体型畸变（chromosome-typeaberration）和染色单体型畸变（chromatid-type aberration） 在细胞分裂的中期相阶段，用显微镜检出的染色体结构改变，表现为缺失、断片、互换等.结构畸变两类.

3.2

染色单体型畸变chromatid-type aberration

染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤.

染色体结构损伤，表现为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组的改变.

有丝分裂指数mitoticindex

中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值，是一项反映细胞增殖程度的指标.

3.5

多倍体polyploidy

体、四倍体等. 哺乳动物细胞染色体数目正常为二倍体，在化学诱变剂的作用下染色体数目成倍地增加，如三倍

4试验目的

本试验检测受试物是否引起培养的哺乳动物细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性.

5试验概述

在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中.用中期分裂相体畸变. 阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色

大部分的致突变剂导致染色单体型畸变，偶有染色体型畸变发生.虽然多倍体的增加可能预示着有染色体数目畸变的可能，但本方法并不适合用于测定染色体的数目畸变.

6试验方法

6.1受试物和试剂

6.1.1受试物的配制

固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加人试验系统和/或用前稀释至适合浓度.受试物应在使用前新鲜配制，否则就必须证实贮存不影响其稳定性.溶剂必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性.首选溶剂是培养液（不含血清）或水，二甲基亚矾（DMSO）也是常用溶剂，使用时浓度不应大于0.5%.

6.1.2剂量设计

6.1.2.1最高浓度的选择

决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗透压（osmolality）的改变.

细胞毒性的确定应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在活化系统存在或不存在的两种条件指数（mitotic index）.应在预试验中确定细胞毒性和溶解度. 下确定细胞毒性，例如细胞覆盖程度（degree of confluency）、活细胞数（viable cell counts）或有丝分裂

6.1.2.2试验剂量

至少应设置3个可供分析的浓度.当有细胞毒性时，其浓度范围应包括从最大毒性至儿乎无毒性：浓度间隔系数通常介于2~√10之间.

在收获细胞时，最高浓度应能明显降低细胞覆盖程度、细胞计数或有丝分裂指数（均应大于50%）.

对于相对无细胞毒性的化合物，最高浓度应是5uL/mL，5mg/mL或0.01mol/L.

对于相对不溶的受试物，在接近不溶解浓度时仍无细胞毒性，则最高剂量应采用染毒结束时的最终培养液中溶解度限值以上的一个浓度，在某些情况下（如细胞毒性仅发生在高于最低不溶解浓度水平），应设一个以上可见沉淀的浓度.

6.1.3对照物

6.1.3.1阳性对照物

可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果.不需要外源性代谢活化系统的阳性物有甲磺酸甲酯（methylmethanesulfon（mitomycin C)、4-硝基喹-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）.需要外源性代谢活化系统的阳性 ate，MMS）、甲磺酸乙酯（ethylmethanesulfonate，EMS）、乙基亚硝基脲（ethy]nitrosourea）、丝裂霉素C2

物有苯并（a）芘[benzo（a）pyrene]、环磷酰胺（cyclophosphamide）.

6.1.3.2阴性对照物

应设阴性对照，即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其他处理和受试物组完全相同.如未能证实所选溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异，还应设空白 对照.

6.1.4培养液

采用Eagle氏最低必需培养基（minimalessentialmedium，Eagle），并加入非必需氨基酸和抗菌素（青、链霉素，按100IU/mL），胎牛血清或小牛血清按10%加人.也可选用其他合适的培养液.

6.1.5活化系统

通常使用的是S9混合物（S9mix）.S9是从经酶诱导剂处理的喘齿动物肝脏获得的.S9的制备见GB/T15670.14-2017的5.7.S9的使用浓度为1%~10%（终浓度）.S9mix中所加辅助因子的量由各实验室自行决定，但需对S9mix的活性进行鉴定，应能明显活化阳性对照物，也可使用下述配方：

S9 0.125 mLMgCl; (0.4 mol/L) 0.02 mLKC1(1.65 mol/L) 0.02 mL葡萄糖-6-磷酸 辅酶Ⅱ（氧化型，NADP) 1.791 mg 3.061 5 mg用无血清MEM培养液补足至1mL.

6.2试验步骤

6.2.1细胞：可使用已建立的细胞株或细胞系，也可使用原代培养细胞.所使用的细胞应该在生长性 能、染色体数目和核型、自发的染色体畸变率等方面有一定的稳定性，推荐使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞株、中国仓鼠肺（CHL）细胞株、人或其他喵乳动物外周血淋巴细胞.

6.2.2试验时，应同时设阳性对照组、阴性对照组和至少3个可供分析的受试物浓度组.

6.2.3试验前一天，将一定数量的细胞接种于培养Ⅲ（瓶）中，置于（0：培养箱内培养.

6.2.4试验需在加入和不加人S9mix的条件下进行.试验时，吸去培养Ⅲ（瓶）中的培养液，加人一定处理3h~6h.结束后，吸去含受试物的培养液，用Hanks液洗细胞3次，加人含10%胎牛血清的培养液，放回培养箱，于24h内收获细胞.收获前2h~4h，加人细胞分裂中期阻断剂（如用秋水仙素，作用时间为4h，终浓度为1μg/mL).

当难以得出明确结论时，应更换试验条件，如改变代谢活化条件、受试物与试验系统接触时间等重复试验.

6.2.5收获细胞时，用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，待细胞脱落后，加人含10%胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放入离心管以1000r/min~1200r/min的速度离心5min~7min，弃去上清液，加人0.075mol/LKC1溶液低渗处理继面以新配制的甲醇和冰乙酸液（容积比为3：1)进 行固定.空气干燥或火焰干燥法常规制片，用姬娜萨染液（pH值6.8~7.0）染色.

6.2.6作染色体分析时，每一处理组分析200个中期分裂相细胞（阳性对照可分析100个中期分裂相细胞）.在分析时应记录每一观察细胞的染色体数目，对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型，结果均用百分比表示.

中华人民共和国国家标准

GB/T15670.17-2017部分代替GB/T156701995

农药登记毒理学试验方法 第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞 染色体畸变试验

Toxicological test methods for pesticides registration-Part 17:Mammalianspermatogonial/spermatocyte chromosome aberration test

中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

前言

GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则：-第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法；第3部分：急性经口毒性试验序贯法； 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；第6部分：急性吸人毒性试验；第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验；第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验； 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验；第13部分：亚慢性毒性试验； 第14部分：细菌回复突变试验；一第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；-一第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第18部分：嘀齿类动物显性致死试验： 一第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验：第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验：第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验：第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验：第23部分：致畸试验； 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；第27部分：致癌试验； 第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第17部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本部分与GB/T15670-1995的小鼠案丸精母细胞染色体畸变试验部分相比主要变化如下： 本部分部分代替GB/T15670-1995《农药登记毒理学试验方法》.修改了本部分的试验名称；修改和调整了标准的总体结构和编排格式；修改了动物要求（见7.2.1995年版的14.6.2）； 一增加了部分章节内容（见第1章、第2章、第3章、第4章、第5章、7.1和第9章）；

GB/T 15670.17-2017

修改了剂量及分组要求（见7.3，1995年版的14.6.3）；修改了染毒方法（见7.4.1，1995年版的14.6.4）；修改了操作步骤（见7.4，1995年版的14.6.5）.本部分由中华人民共和国农业部提出并归口.本部分起草单位：农业部农药检定所. 本部分主要起草人：李宁、张丽英、陶传江.本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T 15670-1995

农药登记毒理学试验方法 第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞 染色体畸变试验

1范围

GB/T15670的本部分规定了哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验的基本原则、方法和要求.

本部分适用于为农药登记面进行的哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验.

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.

GB14925实验动物环境及设施

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件.

染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤.

染色体型畸变chromosome-type aberration

染色体结构损伤，表现为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组的改变.

3.3

裂障gap

染色体和染色单体的损伤长度小于一个染色单体的宽度，为染色单体的最小的错误排列.

3.4

多倍体polyploid

哺乳动物细胞染色体数目正常为二倍体，在化学诱变剂的作用下染色体数目成倍地增加，如三倍体、四倍体等，

3.5

染色体结构畸变chromosomal structure aberration

通过显微镜观察到的细胞分裂中期相的结构改变，如染色体缺失、染色体互换和内交换等.

4试验目的

检测受试物引起哺乳动物生殖细胞染色体畸变的效应，以评价受试物引起生殖细胞遗传突变的可

能性.

5试验概述

诱发染色体型畸变，而作用于G2期时则诱发染色单体型畸变.以适当的染毒途径给动物染毒，并在染 染色体是细胞核中具有特殊结构和遗传功能的小体，当化学物质作用于细胞周期G1期和S期时，毒后适当的时间处死，在动物处死前，动物用中期相阻断剂（如秋水仙素）处理，制备睾丸细胞染色体并染色，对中期相细胞进行染色体畸变分析.

6仅器与试剂

6.1仪器

实验室常用设备.

6.2低渗液

1%柠檬酸三钠：取1g柠檬酸三钠（分析纯），加蒸馏水至100mL. 0.4%氯化钾：取0.4g氯化钾（分析纯），加蒸馏水至100mL.

6.360%冰乙酸

取60mL冰乙酸（分析纯），加蒸缩水至100mL.宜新鲜配制.

6.4固定液

甲醇：冰乙酸=3：1，新鲜配制.

6.5姬姆萨（Giemsa）染液

姬娜萨（Giemsa）染料 gg甲醇 375 mL甘油 125 mL

配制：将姬姆萨（Giemsa）染料和少量甲醇置于研钵里仔细研磨，再加人甲醇到375mL，待完全溶溶解.取出过滤，两周后使用. 解后，再加人125mL甘油，混合均匀.置37℃恒温箱中保温48h.保温期间振摇数次，促使染料充分

6.6磷酸盐缓冲液（pH6.8）

1/15mol/L磷酸氢二钠溶液，称取NaHPO 9.47g溶于1000mL蒸馏水中. 1/15mol/L磷酸二氢钾溶液：称取KHPO 9.07g溶于1000mL燕镐水中.将磷酸氢二钠溶液50ml与磷酸二氢钾溶液50mL混合，用pH计测定并调节至pH6.8.

6.7姬姆萨（Giemsa）应用液

取1份姬姆萨（Giemsa）染液与9份磷酸盐缓冲液（pH6.8）混合面成，临用时现配.

中华人民共和国国家标准

GB/T15670.16-2017部分代替GB/T15670-1995

农药登记毒理学试验方法 第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体 畸变试验

Toxicological test methods for pesticidesregistration-Part 16: In vivo mammalian bone marrow cell chromosome aberration test

中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

前言

GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则：第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法：第3部分：急性经口毒性试验序贯法； 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；第6部分：急性吸人毒性试验；第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验；第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验； 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验；第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验；第13部分：亚慢性毒性试验； 第14部分：细菌回复突变试验；一第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；-一第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第18部分：嘀齿类动物显性致死试验： 一第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验：第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验：第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验：第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验：第23部分：致畸试验； 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验：第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；第27部分：致癌试验； 第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第16部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本部分部分代替GB/T15670-1995《农药登记毒理学试验方法》.修改和调整了标准的总体结构和编排格式；一修改了剂量和分组的内容（见6.3，1995年版的14.5.2）； 修改了对实验动物的要求（见6.2.1995年版的14.5.1）；

本部分与GB/T15670-1995的乳动物骨髓细胞染色体畸变试验部分相比主要变化如下：增加了一些章节内容（见第1章、第2章、第3章、第4章、第5章、6.1和第8章）；

GB/T 15670.16-2017

一修改了染毒方式内容（见6.4，1995年版的14.5.3）；修改了阅片的内容（见6.7，1995年版的14.5.5）.本部分由中华人民共和国农业部提出并归口.本部分起草单位：农业部农药检定所.本部分主要起草人：肖杭、环飞、张函英、陶传江. 本部分所代替标准的历次版本发布情况为：*GB/T 156701995

第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体 农药登记毒理学试验方法 畸变试验

1范围

GB/T15670的本部分规定了体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验的基本原则、方法和要求.本部分适用于为农药登记而进行的体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验.

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.

GB14925实验动物环境及设施

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件.

染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤.

染色体结构损伤，表现为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组的改变.

3.3

在DNA复制的S期后，细胞核并不进人有丝分裂期，而开始另一个S期的过程.其结果是染色体含4、8、16.▪个染色单体.

3.4

裂障gaP

染色体或染色单体损伤的长度小于一个染色单体的宽度，为染色单体的最小的错误排列.

染色体数目改变，不同于所用细胞染色体的正常数目.

3.6

多倍体ployloidy

体、四倍体等.

GB/T 15670.16-2017

3.7

染色体结构畸变chromosomal structure aberration

通过显微镜观察到的细胞分裂中期相的结构改变，如染色体缺失、染色体互换和内交换等.

4试验目的

检测受试物是否引起哺乳动物骨髓细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性.

5试验概述

染色体是细胞核中具有特殊结构和遗传功能的小体，当化学物质作用于细胞周期G1期和S期时，诱发染色体型畸变，面作用于G2期时则诱发染色单体型畸变.给试验的大、小鼠腹腔注入秋水仙素，抑制细胞分裂时纺锤丝的形成，以增加中期分裂相细胞的比例，并使染色体丝缩短、分散、轮廊清晰.在显微镜下观察染色体数目和形态.本方法特别适用于需考虑体内代谢活化后的染色体畸变分析.若有证据表明受试物或其代谢产物不能到达骨髓，则不适用于本方法.

6试验方法

6.1受试物和仪器试剂

6.1.1受试物

首选蒸馏水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、食用淀粉、0.5%羧甲基纤维素钠配成乳浊液或悬浊液.受试物应于滥胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液（或乳浊液、悬浊液）保存具有稳定性.如不是常用溶剂，应有参考资料并说明其成分及选做溶剂的原因.

6.1.2仪器及试剂

6.1.2.3姬姆萨（Giemsa）染液：

姬姆萨（Giemsa）染料 3 8 g甲醇 375 mL甘油 125 mL

解后，再加入125mL甘油，混合均匀.置37C恒温箱中保温48h.保温期间振摇数次，促使染料充分 配制：将姬姆萨（Giemsa）染料和少量甲醇置于研钵里仔细研磨，再加人甲醇至375mL 待完全溶溶解.取出过滤，两周后使用.

6.1.2.4磷酸盐缓冲液（pH6.8）：

1/15mol/L磷酸氢二钠溶液：称取NaHPO 9.47g溶于1000mL蒸馏水中；

1/15mol/L磷酸二氢钾溶液：称取KHPO 9.07g溶于1000mL蒸馏水中；

将磷酸氢二钠溶液50ml与磷酸二氢钾溶液50mL混合，用pH计测定并调节至pH6.8.

6.1.2.5姬娜萨（Giemsa）应用液：取1份姬娜萨（Giemsa）染液与9份磷酸盐缓冲液（pH6.8）混合而成，临用时配制.

6.1.2.6固定液：甲醇（分析纯）与冰乙酸（分析纯）以3：1混合临用时现配.

6.1.2.72.2%柠檬酸钠溶液或0.9%生理盐水，

中华人民共和国国家标准

GB/T 15670.14-2017部分代替GB/T156701995

农药登记毒理学试验方法 第14部分：细菌回复突变试验

Toxicological test methods for pesticides registrationPart 14:Bacterialreverse mutation test

中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

前言

GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：

第1部分：总则；第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法：第3部分：急性经口毒性试验序贯法； 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；第6部分：急性吸人毒性试验；第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验：第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验； 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验；第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验：第13部分：亚慢性毒性试验： 第14部分：细菌回复突变试验；一第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；-一第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验； 第18部分：嘀齿类动物显性致死试验：第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验：第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验：第23部分：致畸试验； 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验：第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；第27部分：致癌试验； 第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第14部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本部分部分代替GB/T15670-1995《农药登记毒理学试验方法》. 本部分与GB/T15670-1995的鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验部分相比主要变化如下：修改和调整了标准的总体结构和编排格式；增加了一些章节内容（见第1章、第2章、第4章、5.6、5.7、6.3、7.3.2、7.3.3和第9章）；修改了对试验菌株要求的内容（见6.1，1995年版的14.3.1）； 修改了部分试剂配制的内容（见5.3，1995年版的14.3.3）：

GB/T 15670.14-2017

一修改了剂量和分组的内容（见7.2，1995年版的14.3.4）；一修改了结果判定的内容（见8.2，1995年版的14.3.8）.本部分由中华人民共和国农业部提出并归口.本部分起草单位：农业部农药检定所.本部分主要起草人：肖杭、环飞、张丽英、陶传江. 本部分所代替标准的历次版本发布情况为：*GB/T 156701995

第14部分：细菌回复突变试验 农药登记毒理学试验方法

1范围

GB/T15670的本部分规定了细菌回复突变试验的基本原则、方法和要求.本部分适用于为农药登记而进行的细菌回复突变试验.

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件.

2.1

回复突变试验reverse mutation test

利用一组鼠伤寒沙门氏菌和/或大肠杆菌检测引起细菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的需要某种氨基酸的菌株（分别为组氨酸或色氨酸）成为不需要外源性供应氨基酸的菌株的突变，即是由营养缺陷型回变到野生型.

2.2

引起DNA分子中一个或多个碱基对置换的物质.在回复突变试验，此改变可能发生在细菌基因组的原突变部位或另一个部位.

2.3

移码型致突变物frameshift mutagens

引起DNA分子增加或丢失一个或多个碱基对的物质.

3试验目的

检测受试物的诱变性，预测其遗传危害和潜在致癌作用的可能性.

4试验概述

对的置换、插人或缺失.原理是通过观察试验菌株在缺乏所需要氨基酸的培养基上的生长情况，检测试 细菌回复突变试验利用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌来检测点突变，涉及DNA的一个或儿个碱基验菌株是否恢复合成必需氨基酸的能力，评价受试物诱发突变的能力.

5培养基和试剂

注：培养基成分或试剂至少应是化学钝，无诱变性.避免重复高温处理选择适当保存温度和期限如肉汤保存于4℃不超过6个月，其他详见下述各培养基及溶液说明.

5.1营养肉汤培养基

牛肉浸膏 5g氯化钠 胰陈 5g 10 g磷酸氢二钾（KHPO3HO） 2.6 g加蒸馏水至 1000 mL加热溶解，调节pH至7.4，分装后0.103MPa，20min灭菌，保存期不超过6个月.

5.2营养肉汤琼脂培养基

琼脂粉 1.5g加营养肉汤培养基至 100 mL加热溶解，调节pH至7.4，0.103MPa，20min灭菌.

5.3底层培养基（即最低营养培养基）

5.3.1Vogel-Bonner（V-B）培养基

柠橡酸（CHO HO） 2.0 g磷酸氢二钾（KHPO） 10.0 g磷酸氢铵钠（NaNHHPO4HO） 3.5 g硫酸镁（MgSO;7HO） 加蒸馏水至 0.2 g 200 mL

逐个将化学物在少量蒸馏水中单独溶解后，硫酸镁水溶液在最后缓慢加人，加蒸馏水至200mL.0.103MPa，20min灭菌，4C保存备用.

5.3.220%葡萄糖溶液

葡萄糖 20.0 g加蒸馏水至100mL，0.055MPa，20min灭菌.

5.3.31.5%底层琼脂培养基

琼脂粉 15 g加蒸馏水至 700 mLV-B培养基 200 mL20%葡萄糖溶液 100 mL

按每Ⅲ25mL（相对于90mm平m）制备平板，冷凝固化后倒置于37C培养箱中24h，备用. 首先将前两种成分于0.103MPa下高压灭菌20min后，再加人后两种成分，充分混匀倒底层平板.

5.4顶层培养基

5.4.1顶层琼脂

琼脂粉 3.0 g加蒸馏水至 氯化钠 2.5 g 500 mL

中华人民共和国国家标准

GB/T15670.15-2017部分代替GB/T15670-1995

农药登记毒理学试验方法 第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染 红细胞微核试验

Toxicological test methods for pesticides registration-Part 15: In vivo mammalian bone marrow polychromatic erythrocytemicronucleus test

中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

前言

GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：

第1部分：总则：第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法；第3部分：急性经口毒性试验序贯法； 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；-第6部分：急性吸人毒性试验；第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验；第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验； 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验；第13部分：亚慢性毒性试验； 第14部分：细菌回复突变试验；一第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；-一第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验； 第18部分：嘀齿类动物显性致死试验：第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验：第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验：第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验：第23部分：致畸试验； 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验：第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；第27部分：致癌试验； 第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第15部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本部分部分代替GB/T15670-1995《农药登记毒理学试验方法》.修改和调整了标准的总体结构和编排格式；增加了一些章节内容（见第1章、第2章、第3章、第4章、第5章、7.1和第8章）；一修改了剂量和分组的内容（见6.3，1995年版的14.4.3）； 修改了对实验动物的要求（见6.2，1995年版的14.4.1）；

GB/T 15670.15-2017

一修改了染毒方式内容（见6.4，1995年版的14.4.3）；修改了阅片的内容（见6.7，1995年版的14.4.4.4）.本部分由中华人民共和国农业部提出并归口.本部分起草单位：农业部农药检定所.本部分主要起草人：肖杭、环飞、张丽英、陶传江. 本部分所代替标准的历次版本发布情况为：*GB/T 156701995

农药登记毒理学试验方法 第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染 红细胞微核试验

1范围

GB/T15670的本部分规定了体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验的基本原则、方法和要求.本部分适用于为农药登记面进行的体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验.

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.

GB14925实验动物环境及设施

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件.

3.1

微核micronucleus

在细胞有丝分裂后期，不能进入子代细胞核中的染色体的断片或迟滞的染色体，在子代细胞胞浆内形成的一个或儿个次核，其与细胞主核着色一致，呈网形或椭圆形.

3.2

嗜多染红细胞polychromatic erythrocytes：PCE

未成熟红细胞，是红细胞成熟过程中的一个中间阶段，此时因胞质内仍含有核糖体保持其嗜碱性约24h，可通过选择性的染色而与成熟红细胞区别开来.

3.3

正染红细胞normochromaticerythrocytes:NCE

成熟红细胞，因其核糖体消失，可通过选择性的染色而与未成熟红细胞区别开来.

4试验目的

增高，以评价受试物致突变的可能性. 检测受试物是否引起哺乳动物骨髓嗜多染红细胞染色体或有丝分裂器损伤而诱导微核细胞发生率

5试验概述

微核是指细胞中主核之外的小核，染色与细胞核一致，相当于细胞直径的1/20~1/5，呈圆形或椭圆形.微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂时滞留在胞核外的遗传物质.因

而，微核试验能检测化学或/和其他物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点.

微核可出现于多种细胞，但在有核细胞中难与正常核的分叶及核突出物区分，故常计数嗜多染红细胞（PCE）中的微核，因为红细胞在成熟之前最后一次分裂后数小时将主核排出，但仍保留微核于嗜多染红细胞中.

6试验方法

6.1受试物及仪器试剂

6.1.1受试物配制

首选蒸馏水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、食用淀粉、0.5%羧甲基纤维素钠配成乳浊液或悬浊液，受试物应于滥胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液（或乳浊液、悬浊液）保存具有稳定性.如不是常用溶剂，应有参考资料并说明其成分及选做溶剂的原因.

6.1.2夜器及其他试剂

6.1.2.1仪器：生物显微镜、恒温水浴箱等.

6.1.2.2小牛血清（灭活）：小牛血清滤菌后置于56C恒温水浴保温30min进行灭活，灭活的小牛血 清通常贮存于4℃冰箱.亦可用大、小鼠血清代替.

6.1.2.3姬娜萨（Giemsa）染液：

姬娜萨（Giemsa）染料 3.8 g甲醇 375 mL甘油 125 mL

配制：将姬姆萨（Giemsa）染料和少量甲醇置于研体里仔细研磨，再加人甲醇到375mL，待完全溶解后，再加人125mL甘油，混合均匀.置37C恒温箱中保温48h.保温期间振摇数次，促使染料充分溶解.取出过滤，两周后使用.

6.1.2.4磷酸盐缓冲液（pH6.8）：

1/15mol/L磷酸氢二钠溶液：称取NaHPO 9.47g溶于1000mL蒸馏水中.

1/15mol/L磷酸二氢钾溶液：称取KHPO 9.07g溶于1000mL蒸馏水中.

将磷酸氢二钠溶液50mL与磷酸二氢钾溶液50mL混合用pH计测定并调节至pH6.8.

6.1.2.5姬姆萨（Giemsa）应用液：取1份姬娜萨（Giemsa）染液与6份磷酸盐缓冲液（pH6.8）混合而成，临用时配制.

6.1.2.6甲醇（分析纯）.

6.2实验动物

6.2.1动物选择

微核试验推荐使用小鼠，也可选用大鼠.通常用7周～12周，体重25g～30g的小鼠或体重150g~200g的大鼠.动物随机分组，每组用两种性别的动物至少各5只.在试验开始时，动物体重差异应不 超过同性别平均体重的土20%.

6.2.2饲养环境

规定， 试验前，动物应在何养环境中检疫、适应3d～5d，实验动物饲养环境应符合GB14925的有关

中华人民共和国国家标准

GB/T15670.13-2017部分代GB/T15670-1995

农药登记毒理学试验方法 第13部分：亚慢性毒性试验

Toxicological test methods for pesticides registration-Part 13:Subchronic toxicity study

中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

前言

GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：

第1部分：总则：第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法；第3部分：急性经口毒性试验序贯法； 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；第6部分：急性吸人毒性试验；一第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验：第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验； 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验：第13部分：亚慢性毒性试验； 第14部分：细菌回复突变试验；一第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；-一第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第18部分：嘀齿类动物显性致死试验： 一第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验：第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验；第23部分：致畸试验： 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；第27部分：致癌试验； 第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第13部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本部分部分代替GB/T15670-1995《农药登记毒理学试验方法》. 本部分与GB/T15670-1995的亚慢性经口毒性试验相比主要变化如下：修改和调整了标准的总体结构和编排格式；修改了剂量与分组要求（见6.3，1995年版的11.5）； 修改了实验动物要求（见6.2.1995年版的11.3）；

GB/T 15670.13-2017

修改了染毒途径（见6.4，1995年版的11.6）；修改了观察指标（见6.6，1995年版的11.7）.本部分由中华人民共和国农业部提出并归口.本部分起草单位：农业部农药检定所.本部分主要起草人：李宁、张丽英、曲凳、陶传江. 本部分所代替标准的历次版本发布情况为：*GB/T 15670-1995

农药登记毒理学试验方法 第13部分：亚慢性毒性试验

1范围

GB/T15670的本部分规定了亚慢性毒性试验的基本原则、方法和要求.

本部分适用于为农药登记而进行的亚慢性毒性试验.

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.

GB14925实验动物环境及设施

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件.

3.1

亚慢性毒性subchronic toxicity

实验动物在其部分生存期内每日反复接触受试物后引起的健康损害效应.

3.2

在规定的试验条件下，用现有技术手段和检测指标，未能观察到与染毒有关的有害效应的受试物最高剂量或浓度.

'

观察到有害作用最低剂量水平lowestobserved adverse effect level;LOAEL

在规定的试验条件下，用现有技术手段和检测指标，观察到与染毒有关的有害效应的受试物最低剂量或浓度.

3.4

靶器官target organ

受试物引起机体出现显著毒性效应的器官.

4试验目的

通过亚慢性毒性试验，确定在较长时间内（包括断乳后生长期到生长进人成年期）反复接触受试物引起的毒性效应，了解受试物的毒作用靶器官和可能的蓄积效应，求出受试物的未观察到有害作用剂量水平、观察到有害作用最低剂量水平，为慢性毒性试验剂量选择和初步制定人群安全接触限量标准提供 科学依据.

5试验概述

受试物以不同剂量反复经口、经皮或经呼吸道给予实验动物，染毒90d或180d，观察动物的中毒表现、定期称量体重和计算摄食量，并进行血液生化指标、血液学指标、组织病理学检查指标等的测定.

6试验方法

6.1受试物配制

6.1.1激胃染毒时，根据受试物的特性选择合适的溶剂或载体，将受试物溶解或悬浮在合适的介质中.通常首选溶剂为水，不溶于水的受试物可使用食用油（如橄榄油、玉米油等），不溶于水或油的受试物可 使用羧甲基纤维素钠、淀粉等配成混悬液.将受试物掺人饲料或饮水给予时，要将受试物与水或饲料混匀并保证该受试物配制的稳定性，应进行稳定性、含量和均一性的测定，浓度应在理论浓度的土15%以内.受试物掺入饲料或水时，应不影响饲料营养质量和水的平衡，一般在饲料中的掺人量不超过何料浓度的5%.如果受试物加人饲料或水中会影响动物的适口性，则应灌胃给予受试物.

6.1.2经皮和呼吸道吸入途径染毒，常以原药形式染毒或溶解在合适的介质中.

6.2实验动物

晒齿类动物首选大鼠，经皮染毒动物还可选白色家免和豚鼠，雌、雄两种性别，大鼠周龄一般应为6周~8周.非哦齿类动物首选狗，常用的品系为beagle狗，应选用雌、雄两种性别，动物的月龄一般为4月～6月.每个动物起始体重的差异应不超过同性别动物平均体重的土20%.每组大鼠应至少选用 20只动物，每组狗至少选用8只动物，雌雄各半，必要时应增加动物数，以使试验结束时保留一些动物做恢复期的观察.动物购买后于试验前适应环境5d~7d，适应期应进行检疫观察.

实验动物房应符合GB14925的有关规定.试验期间自由饮水和摄食，大鼠按性别分笼饲养，可单饲或样饲，样饲时每笼的动物数应以不影响动物自由活动或观察动物的表现为宜.

6.3剂量设计与分组

6.3.1剂量分组

至少应设三个剂量组和一个对照组.原则上高剂量组的动物应当出现明显中毒表现但不引起动物死亡，低剂量组应不引起毒性作用并应高于人的实际接触水平，中剂量可产生轻度的毒性以求出未观察到有害作用剂量水平和观察到有害作用最低剂量水平.对照组为溶剂对照组或介质对照组，除不给设配对饲养对照组. 予受试物外，其余处理均与剂量组相同，当掺人何料染毒时，如果食物摄入量和利用率降低，则需考虑

6.3.2附加组

如果需要，可增设附加试验组和附加对照组，嗜齿类动物数每组至少10只（雌雄各半），非齿类动照组.在染毒结束后继续观察至少28d，进行相关指标测定，以观察受试物毒性的可逆性、持续性和迟 物动物数每组为8只动物（雌雄各半），附加试验组给予高剂量染毒，附加对照组为溶剂对照组或介质对发效应.

6.3.3限量试验

如果预期在1000mg/kg体重、1mg/L（或可发生的气溶胶最高浓度）剂量不可能产生任何毒性影2

中华人民共和国国家标准

GB/T15670.12-2017部分代替GB/T156701995

农药登记毒理学试验方法 第12部分：短期重复吸入染毒（28天） 毒性试验

Toxicological test methods for pesticidesregistration-Part 12:Short-term repeated dose 28-day inhalation toxicity study

中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

前言

GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：

第1部分：总则；第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法；第3部分：急性经口毒性试验序贯法； 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法：第5部分：急性经皮毒性试验；第6部分：急性吸人毒性试验；第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验：第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验； 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验；第13部分：亚慢性毒性试验； 第14部分：细菌回复突变试验；一第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；-一第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验； 第18部分：嘀齿类动物显性致死试验：第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验：第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验：第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验；第23部分：致畸试验； 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第27部分：致癌试验； 第26部分：慢性毒性试验；第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第12部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本部分与GB/T15670-1995的亚急性吸人毒性试验部分相比，主要变化如下： 本部分部分代替GB/T15670-1995《农药登记毒理学试验方法》.本部分改命名为《短期重复吸人染毒（28天）毒性试验》；修改和调整了总体结构和编排格式：增加或细化了一些章节的内容（第1章、第2章、第3章、第5章、6.1.1、6.1.2、6.1.3、6.1.4、 第7章和第8章）；

GB/T 15670.122017

修改了对实验动物的要求（见6.1.5，1995年版的10.3）；一在反复吸人染毒暴露的实施描述之中，将染毒时间修改为：“除有特殊要求之外，一般每日吸人染毒6h，每周7d，连续染毒28d.考虑到实际工作情况，也可每周染毒5 d”（见6.2.1.2，1995年版的10.6).本部分由中华人民共和国农业部提出并归口. 本部分起草单位：农业部农药检定所.本部分主要起草人：丁日高、张宝真、陶传江、张丽英.本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T 156701995

第12部分：短期重复吸入染毒（28天） 农药登记毒理学试验方法 毒性试验

1范围

GB/T15670的本部分规定了短期重复吸人染毒（28天）毒性试验的基本原则、方法和要求.本部分适用于为农药登记而进行的短期重复吸人染毒（28天）毒性试验.

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.

GB14925实验动物环境及设施

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件.

3.1

短期重复吸入染毒毒性short-termrepeated dose inhalation toxicity

在短于实验动物寿命的10%期限内重复吸人受试物后所引起的健康损害效应.

3.2

吸入剂量inhaled dose

动物单位体重所吸人受试物的量，即：

(1)

式中：

Da-吸入剂量，单位为毫克每千克（mg/kg）；吸入气中受试物的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；! 吸入持续时间，单位为分（min）；R T.受试动物的潮气量，单位为升每次（L/次）： 呼吸赖率，单位为次每分（次/min）；与受试物反应性和溶解性相关的保持系数；W体重，单位为千克（kg）.

3.3

未观察到有害作用剂量水平no observed adverseeffect level：NOAEL

高剂量或浓度. 在规定的试验条件之下，用现有技术手段和检测指标，未观察到与染毒有关的有害效应的受试物最

3.4

观察到有害作用最低剂量水平lowestobservedadverseeffectlevel:LOAEL

在规定的试验条件之下，用现有技术手段和检测指标，观察到与染毒有关的有害效应的受试物最低剂量或浓度.

3.5

蓄积毒性cumulative toxicity

重复染毒引起的不良反应，是由于受试物对敏感组织作用的延续或该受试物和/或其代谢产物的浓度在敏感组织中增高的结果.

9

靶器官target organ

受试物引起机体出现显著毒性效应的器官.

3.7

空气动力学直径aerodynamic equivalent diameter：AD

描述气溶胶颗粒大小的专用术语.

的终端沉降速度相同时，就以该标准球形颗粒的直径表示此气溶胶颗粒的直径，并称之为该气溶胶颗粒 将不同形状和密度的气溶胶颗粒与不同直径的标准单位密度（1.0g/cm²）球形颗粒相对比，当它们的空气动力学直径，其计量单位为微米（pm）.

3.8

质量中值空气动力学直径mass median aerodynamic diameter;MMIAD

由空气动力学直径大小不一的颗粒组成的气溶胶样品中，小于和等于某一空气动力学直径（例如5μm）的颗粒占气溶胶样品总质量或总重量50%时，则该气溶胶颗粒空气动力学直径即为此气溶胶样品的质量中值空气动力学直径（5pm）.

3.9

几何标准差geometric standard deviation:GSD

气溶胶颗粒空气动力学直径的儿何标准差，用以描述气溶胶颗粒大小的均一性或离散程度.几何标准差越小，含相似大小的颗粒比例越高，亦即气溶胶颗粒的均一性越好，离散度越低.通常，将儿何标准差小于或等于2的气溶胶样品称为单相分散气溶胶.

3.10

可吸入颗粒直径inhalable diameter

通常将空气动力学直径在10μm以下的气溶胶题粒物称为可吸入颗粒物，可吸入颗粒的空气动力学直径的大小简称为可吸人颗粒直径.

4试验目的

通过短期重复吸人染毒（28天）毒性试验，进一步了解受试物的吸人毒性特征和剂量-反应关系，获得毒性特征、作用靶器官、受试物是否具有蓄积毒性、未观察到有害作用剂量水平（NOAEL）、观察到有害作用最低剂量水平（LOAEL）等信息，为亚慢性和慢性毒性试验剂量和观察指标的选择提供依据.

5试验概述

将受试物制备成特定浓度的气态、蒸汽态、气溶胶或题粒状物混悬态，以动式染毒系统短期重复染毒28d，观察动物的中毒反应定期称量体重和计算摄食量，并进行血液学指标、血液生化指标、组织病理学检查指标等的测定，以评价受试物的短期重复吸人毒性，初步确定受试物引起动物有害效应的剂量 2

中华人民共和国国家标准

GB/T15670.11-2017部分代替GB/T156701995

农药登记毒理学试验方法 第11部分：短期重复经皮染毒（28天） 毒性试验

Toxicological test methods for pesticides registrationPart 11:Short-term repeated dose 28-day dermal toxicity study

中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

前言

GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：

第1部分：总则；-第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法；第3部分：急性经口毒性试验序贯法； 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；第6部分：急性吸人毒性试验：一第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验：第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验； 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验：第13部分：亚慢性毒性试验； 第14部分：细菌回复突变试验：一第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验：-第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第18部分：嘀齿类动物显性致死试验： 一第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验：第23部分：致畸试验； 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；第27部分：致癌试验； 第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第11部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本部分与GB/T15670-1995的亚急性经皮毒性试验部分相比主要变化如下： 本部分部分代替GB/T15670-1995（农药登记毒理学试验方法》.-修改和调整了总体结构和编排格式：增加了“规范性引用文件”（见第2章）；增加了“试验概述”（见第5章）： 增加了“术语和定义"（见第3章）；

一改"试验农药”为"受试物”，对固体受试物的处置、受试物的稀释、配制提出了具体要求（见6.1，1995年版的9.2）：一一对剂量的设置和分组，提出了更明确的要求，提出必要时另设附加高剂量染毒组和附加对照组以了解毒作用的持续性、可逆性或迟发毒作用（见6.3，1995年版的9.4）：用“试验步骤”代替原来的“给药方法”给药时间”，为保证试验结果的可复演性，特别强调了观 察并记录受试物的染毒剂量、浓度、容量，染毒面积和染毒密度，以及染毒环境的微小气候如温度、湿度和风速（见6.4，1995年版的9.5）；增加了试验结果和评价”（见第7章）；增加了“试验报告”（见第8章）.本部分由中华人民共和国农业部提出并归口. 本部分起草单位：农业部农药检定所.本部分主要起草人：张宝真、张丽英、陶传江.本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T 15670-1995

第11部分：短期重复经皮染毒（28天） 农药登记毒理学试验方法 毒性试验

1范围

GB/T15670的本部分规定了短期重复经皮染毒（28天）毒性试验的基本原则、方法和要求.本部分适用于为农药登记面进行的短期重复经皮染毒（28天）毒性试验.

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.

GB14925实验动物环境及设施

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件.

3.1

短期重复经皮染毒毒性short-term repeated dose dermal toxicity

在短于实验动物寿命的10%期限内重复经皮染毒所引起的健康损害效应.

3.2

未观察到有害作用剂量水平no observed adverse effectlevel：NOAEL

高剂量或浓度. 在规定的试验条件下，用现有技术手段和检测指标，未能观察到与染毒有关的有害效应的受试物最

观察到有害作用最低剂量水平lowestobserved adverse effect level：LOAEL

在规定的试验条件下，用现有技术手段和检测指标，观察到与染毒有关的有害效应的受试物最低剂量或浓度.

3.4

靶器官target organ

受试物引起机体出现显著毒性效应的器官.

4试验目的

通过短期重复经皮染毒（28天）毒性试验，提供在规定的试验期内，经皮重复接触受试物后引起的健康危害资料，初步了解受试物经皮的渗透性、毒性特征、作用靶器官等，从剂量-效应和剂量-反应关系方面获得未观察到有害作用剂量水平（NOAEL）、观察到有害作用最低剂量水平（LOAEL）的信息，也可为亚慢性和慢性经皮染毒毒性试验剂量和观察指标的选择提供依据.

5试验概述

以不同剂量受试物每日分别涂布于实验动物皮肤上，连续28d，染毒期间每日观察动物的毒性反应，定期称量体重和计算摄食量，并进行血液学指标、血液生化指标、组织病理学检查指标等的测定，以 评价受试物的短期重复经皮毒性，初步确定受试物引起动物有害效应的剂量和靶器官.

6试验方法

6.1受试物

通透性、也不与受试物反应的介质充分湿润，以保证受试物与皮肤有良好的接触. 液态受试物一般使用原液.固体受试物应粉碎成粉状，并用水或其他无毒、无剩激性、不影响皮肤

受试物如需稀释、配制，应在临染毒前进行，除非能证明配制物是稳定的，否则需进行化学分析来证实.

6.2实验动物

6.2.1种属和体重

试验作为长期毒性试验的预备试验时，则在两项试验中所使用的动物品、系应当相同.试验开始时动物 可采用成年大鼠、家免或豚鼠进行试验，也可使用其他动物，但需说明理由.当短期重复染毒毒性体重范围为：大鼠200g~300g，家兔2.0kg~3.0kg，豚鼠350g~450g.试验开始时实验动物体重的个体差异不得超过同性别平均体重的土20%.

6.2.2动物性别和数量

每一剂量组至少应有10只（雌、维各半）皮肤健康的动物.雌性动物应为未妊娠和未经产的.若计划在试验过程中处死动物，应增加相应的动物数.

6.2.3饲养环境

动物宜单笼饲养.动物饲养环境应符合GB14925的有关规定.选用常规何料，饮水量不限.试验前动物应在饲养环境中检疫、适应3d～5d，再随机分配到各试验剂量组、对照组和附加组中.

6.3剂量和分组

6.3.1至少设三个染毒剂量组和一个对照组，对照组除不接触受试物外，其他条件均与试验组相同. 高剂量组的设计应在引起明显中毒效应的前提下不致造成动物死亡：低剂量组应不出现毒性效应，若已知人群可能的接触水平，则低剂量应高于人群的实际接触水平：中间剂量应引起较轻的可观察到的毒性效应.若设多个中间剂量组，则各组的染毒剂量应有适当的间隔，以保证引起不同程度毒性效应.

若受试物引起严重的皮肤损伤效应则应降低受试物的使用浓度，尽管这样可导致原来在较高浓度下出现的其他毒性作用减弱或消失，若在试验初期动物的皮肤受到严重损伤，则有必要终止试验，并使 用较低的浓度重新开始试验.

必要时，可增设附加高剂量染毒组和附加对照组.每组各10只动物（雌、雄各半）.附加高剂量组给予高剂量受试物，染毒28d，全程染毒结束后继续观察不少于14d，以了解毒性作用的可递性、持续性和迟发效应.

6.3.2限量试验：本项试验中，如果接触水平大于或等于1000mg/kg体重时仍未产生可观测到的毒2

中华人民共和国国家标准

GB/T15670.10-2017 部分代GB/T15670-1995

农药登记毒理学试验方法 第10部分：短期重复经口染毒（28天） 毒性试验

Toxicological test methods for pesticides registration-Part 10:Short-term repeated dose 28-day oral toxicity study

中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

前言

GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：

第1部分：总则；第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法：第3部分：急性经口毒性试验序贯法； 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；第6部分：急性吸人毒性试验；第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验：第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验； 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验；第13部分：亚慢性毒性试验； 第14部分：细菌回复突变试验；一第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；-一第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第18部分：嘀齿类动物显性致死试验： 一第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验：第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验：-第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验：第23部分：致畸试验； 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；第27部分：致癌试验； 第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第10部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本部分部分代替GB/T15670-1995《农药登记毒理学试验方法》. 本部分与GB/T15670-1995的亚急性经口毒性试验相比主要变化如下：修改和调整了标准的总体结构和编排格式；增加了一些章节内容（见第1章、第2章、第3章、第5章、6.1、第7章和第8章）：一修改了剂量与分组要求（见6.3，1995年版的8.4）； 修改了实验动物的要求（见6.2.1995年版的8.3）；

GB/T 15670.10-2017

修改了临床观察和检查指标（见6.5，1995年版的8.7）.本部分由中华人民共和国农业部提出并归口.本部分起草单位：农业部农药检定所.本部分主要起草人：孙金秀、李宁、张丽英、陶传江，本部分所代替标准的历次版本发布情况为： *GB/T 156701995

第10部分：短期重复经口染毒（28天） 农药登记毒理学试验方法 毒性试验

1范围

GB/T15670的本部分规定了短期重复经口染毒（28天）毒性试验的基本原则、方法和要求.本部分适用于为农药登记面进行的短期重复经口染毒（28天）毒性试验.

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.

GB14925实验动物环境及设施

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件.

3.1

短期重复经口染毒毒性short-term repeated dose oral toxicity

在短于实验动物寿命的10%期限内重复经口给予受试物所引起的健康损害效应.

3.2

未观察到有害作用剂量水平no observed adverse effectlevel：NOAEL

高剂量或浓度. 在规定的试验条件下，用现有技术手段和检测指标，未能观察到与染毒有关的有害效应的受试物最

观察到有害作用最低剂量水平lowestobserved adverseeffeet level：LOAEL

在规定的试验条件下，用现有技术手段和检测指标，观察到与染毒有关的有害效应的受试物最低剂量或浓度.

3.4

靶器官target organ

受试物引起机体出现显著毒性效应的器官.

4试验目的

通过短期重复经口染毒（28天）毒性试验，确定在较短时间内经口重复接触受试物后引起的毒性效应，初步了解受试物的毒作用特征、剂量-反应关系和靶器官等，获得未观察到有害作用剂量水平（NOAEL）、观察到有害作用最低剂量水平（LOAEL），为亚慢性和慢性毒性试验剂量和观察指标的选择等 提供依据.

5试验概述

实验动物在短期内反复经口染毒28d，观察动物的毒性反应，定期称量体重和计算摄食量，并进行定受试物引起动物有害效应的剂量和靶器官. 血液学指标、血液生化指标、组织病理学检查指标等的测定，以评价受试物的短期重复摄入毒性，初步确

6试验方法

6.1受试物配制

受试物掺人饲料或饮水给予，为保证受试物配制的均一性、稳定性，应进行稳定性、含量和均一性的的掺入量不超过饲料浓度的5%.受试物加人饲料或水中影响动物的适口性时，应灌胃给予受试物.灌胃染毒时，应将受试物溶解或悬浮在合适的介质中，通常首选溶剂为水，不溶于水的受试物可使用食用油（如嫩榄油、玉米油等），不溶于水或油的受试物可使用羧甲基纤维素钠、淀粉等配成混悬液.

6.2实验动物

首选健康初成年大鼠，雌、雄两种性别，大鼠周龄一般应为6周～8周.每个动物起始体重的差异应不超过同性别平均体重的土20%.每组至少选用10只大鼠，雌雄各半，雌性动物应为未妊娠和未经 产的，必要时增加动物数.如试验需要，可设附加组以使试验结束时保留一些动物做恢复期的观察.动物购买后于试验前适应环境3d~5d，适应期应进行检疫观察.

实验动物房应符合GB14925的有关规定，试验期间自由饮水和摄食，大鼠按性别分笼饲养，可单饲或群词，群饲时每笼的动物数应以不影响动物自由活动或观察动物的反应为宜.

6.3剂量设计与分组

6.3.1剂量分组

至少应设三个剂量组和一个对照组.原则上高剂量组的动物在染毒期间应当出现明显中毒表现但不引起动物死亡，低剂量组应不引起毒性作用并应高于人的实际接触水平，中剂量可产生轻微的毒性，以求出未观察到有害作用剂量水平和观察到有害作用最低剂量水平.对照组为溶剂对照组或介质对照组，除不给予受试物外，其余处理均与剂量组相同.当掺入饲料染毒时，食物摄入量和利用率降低时，需 考虑设配对饲养对照组.

6.3.2附加组

附加对照组为溶剂对照组或介质对照组.在染毒结束后继续观察至少14d，进行相关指标测定，以观察 按需要可增设附加试验组和附加对照组，每组10只动物（雌雄各半），附加试验组给予高剂量染毒，受试物毒性的可逆性、持续性和迟发效应.

6.3.3限量试验

如果预期在1000mg/kg体重剂量不可能产生任何毒性影响，或根据结构可预测到其不会产生毒性时，可不必设定三个剂量.

6.4染毒途径

2 可将受试物混入伺料或饮水，或采用灌胃法染毒.动物应每周染毒7d；如采用灌胃法，每日滥胃一

中华人民共和国国家标准

GB/T 15670.9-2017部分代替GB/T15670-1995

农药登记毒理学试验方法 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验

Toxicological test methods for pesticides registrationPart 9:Skin sensitisation test

中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

前言

GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则：第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法；第3部分：急性经口毒性试验序贯法； 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；第6部分：急性吸人毒性试验；第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验：第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验； 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验；第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验；第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验：第13部分：亚慢性毒性试验： 第14部分：细菌回复突变试验：一第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；-一第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第18部分：嘀齿类动物显性致死试验： 第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验；一第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验：一第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验：第23部分：致畸试验； 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验：第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验：第27部分：致癌试验； 第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第9部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本部分与GB/T15670-1995的皮肤变态反应（致敏）试验部分相比主要变化如下： 本部分部分代替GB/T15670-1995《农药登记毒理学试验方法》.修改和调整了标准的总体结构和编排格式；一增加了一些章节内容（见第1章、第2章、第3章、第5章、6.1、6.2、6.3.3.4、6.3.3.6、6.4、6.5和一修改了对实验动物的要求（见6.3.1，1995年版的7.3）； 第7章）；

GB/T 15670.9-2017

修改了对阳性和阴性对照组设置的要求（见6.3.3.5，1995年版的7.5.2）；修改了结果评定的内容（见6.3.4，1995年版的7.6）：一增加了原鼠最大值试验和小鼠局部淋巴结分析试验两个试验方法（见6.4、6.5）.本部分由中华人民共和国农业部提出.本部分由中华人民共和国农业部种植业管理司归口. 本部分起草单位：农业部农药检定所.本部分主要起草人：张宏伟、张丽英、曲亮费、陶传江.本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T 156701995

农药登记毒理学试验方法 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验

1范围

GB/T15670的本部分规定了皮肤变态反应（致敏）试验的基本原则、方法和要求.本部分适用于为农药登记面进行的皮肤变态反应（致敏）试验.

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.

GB14925实验动物环境及设施

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件.

3.1

皮肤变态反应skin sensitization

过敏性接触性皮炎allergic contact dermatitis

皮肤对一种物质产生的免疫源性皮肤反应.人类这种反应可能以瘙痒、红斑、丘疹、水疱、融合水疱为特征，动物的反应不同，可能只见到皮肤红斑和水肿.

诱导接触induction exposure

机体通过接触受试物而诱导出过敏状态的试验性暴露.

机体通过接触受试物而诱导出过敏状态所需的时间，一般至少1周.

激发接触challengeexposure

机体接受诱导暴露后，再次接触受试物的试验性暴露，以确定皮肤是否会出现过敏反应.

刺激指数stimulation index：SI

）基脱氧胸腺嘧啶昔或1-碘苷的结合值的比值（率）.

4试验目的

确定重复接触受试物对哺乳动物是否可引起皮肤变态反应及其程度.

5试验概述

局部封闭涂皮试验（Buehler test BT）和豚鼠最大值试验（guinea pig maximisation test GPMT）是实验动物通过多次皮肤涂抹（诱导接触）或皮内注射受试物10d~14d（诱导阶段）后，给予激发剂量的 受试物，观察实验动物，并与对照动物比较对激发接触受试物的皮肤反应强度.

小鼠局部淋巴结分析试验（locallymph nodeassay，LLNA）是通过耳部给予实验动物受试物，引起淋巴结的淋巴细胞增生，淋巴细胞增生与受试物剂量（过敏程度）成比例.利用放射性标记方法，测定试验组与对照组淋巴细胞的标记率，并进行对比，获得刺激指数，评价致敏强度.

6试验方法

6.1实验动物和饲养环境

局部封闭涂皮试验和原鼠最大值试验宜选用健康、成年雄性或雌性豚鼠，雌性动物应选用未妊娠和未经产的.

鼠.体重变异不超过平均体重的土20%.除非有充分证据说明其他的种系或性别在此试验中对结果没 小鼠局部淋巴结分析试验宜选用健康、8周～12周雌性未妊娠和未经产的CBA/Ca或CBA/J小有影响，原则上不采用其他的种系或性别动物.

实验动物饲养环境和条件应符合GB14925的有关规定.选用常规何料，饮水不限制，豚鼠需注意补充适量Vc.

6.2动物试验前准备

试验前动物在实验动物房环境中至少检疫、适应5d时间.将动物随机分为受试物组和对照组，按所选用的试验方法，选择适当部位给动物备皮（去毛），避免损伤皮肤.小鼠局部淋巴结分析试验不要采用耳部标记记号的方式.试验开始和结束时应记录动物体重.

无论在诱导阶段或激发阶段均应对动物进行全面观察，包括全身反应和局部反应，并作完整记录.

6.3局部封闭涂皮试验（BuehlerTest，BT）

6.3.1动物数

试验组至少20只，对照组至少10只.

6.3.2剂量水平

诱导接触受试物浓度为能引起皮肤轻度刺激反应的最高浓度，激发接触受试物浓度为不能引起皮肤刺激反应的最高浓度.试验浓度水平可以通过少量动物（2只～3只）的预试验获得.

水溶性受试物可用水或用无刺激性表面活性剂作为溶剂非水溶性受试物如脂溶性受试物可用食用油或其他无刺激性、无致敏性的表面活性剂作溶剂，当受试物在诱导接触中用80%乙醇做溶剂时，则在激发接触中应用丙酮作溶剂.

6.3.3试验步骤

6.3.3.1动物的准备

试验前约24h，将豚鼠背部左侧去毛，去毛范围为4cm²~6cm².

中华人民共和国国家标准

GB/T 15670.8-2017部分代替GB/T15670-1995

农药登记毒理学试验方法 第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验

Toxicological test methods for pesticides registrationPart 8:Acute eye irritation/corrosion test

中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

前言

GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：

第1部分：总则：第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法：第3部分：急性经口毒性试验序贯法； 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；第6部分：急性吸人毒性试验；第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验：第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验； 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验：第13部分：亚慢性毒性试验； 第14部分：细菌回复突变试验：一第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；-一第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验： 第18部分：嘀齿类动物显性致死试验：第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验：第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验：-第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验：第23部分：致畸试验； 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验：第27部分：致癌试验； 第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第8部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本部分部分代替GB/T15670-1995（农药登记毒理学试验方法》. 本部分与GB/T15670-1995的眼刺激试验部分相比主要变化如下：修改和调整了标准的总体结构和编排格式；修改了眼报害的评分标准（见表1.1995年版的表6）； 修改了实验动物数量的要求（见6.2.1.1995年版的6.3）；

GB/T 15670.8-2017

修改了眼刺激性反应分级（见表2，1995年版的表7）.本部分由中华人民共和国农业部提出.本部分由中华人民共和国农业部种植业管理司归口.本部分起草单位：农业部农药检定所.本部分主要起草人：秦钰慧、曲亮、张丽英、陶传江. 本部分所代替标准的历次版本发布情况为：*GB/T 156701995

农药登记毒理学试验方法 第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验

1范围

本部分适用于为农药登记而进行的急性眼刺激性/腐蚀性试验. GB/T15670的本部分规定了急性眼刺激性/腐蚀性试验的基本原则、方法和要求.

2规范性引用文件

件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

GB14925实验动物环境及设施

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件.

眼睛刺激性eye irritation

眼睛表面接触受试物后发生的可递性炎性变化，在21d内完全恢复.

眼睛腐蚀性eyecorrosion

眼睛表面接触受试物后发生的不可逆性组织损伤，在21d内不能完全恢复.

4试验目的

确定和评价受试物对哺乳动物的眼睛是否有刺激作用或腐蚀作用及其程度.

5试验概述

受试物以一次剂量滴入（放人）每只实验动物的一侧眼睛结膜囊内，以未作处理的另一侧眼睛作为的刺激作用观察期限应能足以评价刺激效应的可逆性或不可递性. 自身对照.在规定的时间间隔内，观察动物眼睛的刺激和腐蚀作用程度并评分，以此评价受试物对眼睛

6试验方法

6.1受试物

磨成细粉状，染毒量应为0.1mL或100mg，气溶胶产品需撑开免眼，在眼正前方10cm处，对准兔眼 液体受试物一般不需稀释，直接使用原液，染毒量为0.1mL.若受试物为固体或颗粒状，应将其研

按压气溶胶喷雾器1s，注意不要因为压力面损伤眼睛.

受试物pH值≤2或>11.5，或已证实对皮肤有腐蚀性，或有文献资料及其他方法预测对眼有严重剩激/腐蚀性，可以不再进行眼刺激性/腐蚀性试验，但该受试物应视为对眼具有腐蚀性.

6.2实验动物

6.2.1动物选择

首选健康成年白色家免，体重2.0kg~3.0kg.如果选用其他种属实验动物，则需要说明合理的特殊理由.至少使用3只家免.试验开始前的24b内对实验动物的两只眼睛进行检查（包括使用荧光素 钠检查），眼睛有红肿、炎症以及眼睛缺陷和角膜损伤的动物不能用于试验.

6.2.2饲养环境

实验动物应单笼饲养，试验前动物在实验动物房环境中至少检疫、适应3d.实验动物饲养环境及条件应符合GB14925的有关规定，选用常规何料和饮水.

6.3试验方法

6.3.1轻轻拉开家兔一侧眼睛的下眼险，将受试物0.1mL（或100mg）滴人（放人）结膜囊中，使上、下眼险被动闭合1s，以防止受试物丢失.另一侧眼睛不处理作自身对照.一般情况下，滴入（放入）受试物后24h内不冲洗眼晴.

6.3.2若72h剩激反应不消失，应另选用3只家兔进行冲洗效果试验，即给家兔眼滴入（放入）受试物 后30s，用足量、流速较快但又不会引起动物眼损伤的水流冲洗至少308.

6.3.3如果预期受试物会造成动物极度疼痛，可考虑在给予受试物前使用局麻药，对照眼作同样处理，局麻药的类型和浓度应慎重选择，确保不影响受试物的作用.

6.4临床观察和检查

在滴人（放人）受试物后1h、24h、48h、72h以及第4天和第7天对动物眼晴进行检查.如果72h未出现刺激反应或刺激反应完全恢复，即可终止试验.如果发现累及角膜或有其他眼刺激作用，7d内不恢复者，为确定该损害的可逆性或不可逆性，应延长观察时间，一般不超过21d，并提供第7天、第14天、第21天的观察报告.除了对角膜、虹膜、结膜进行观察外，其他损害效应均应当记录并报告.在每次检查中均应按表1眼损害的评分标准记录眼刺激反应的评分.

可使用放大镜、手持裂原灯、体视显微镜或其他适用的仅器设备进行眼刺激反应检查.在24h观察和记录结束之后，对动物的眼睛应用荧光素钠（浓度1%～2%）作进一步检查.

动物如出现角膜穿孔、角膜溃疡、眼前房出血、角膜混浊4分超过48h、缺乏光反射（虹膜反应2分）超过72h、结膜溃疡、坏死等情况，通常为不可逆损伤的表现，应给予人道处死.

7试验结果和评价

7.1试验结果

按表1的评分标准记录眼刺激反应评分，按表2判定眼刺激性反应分级，对眼刺激性反应试验结果应以表格的形式进行汇总，并有详细的文字描述，包括是否出现眼以外的反应以及全身反应.